銅及其與四環素的聯合暴露對斑馬魚胚胎的毒性效應

章強，辛琦，強麗媛，程金平,*

1. 華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海 200062 2. 香港城市大學深圳研究院，深圳 518057

銅及其與四環素的聯合暴露對斑馬魚胚胎的毒性效應

章強1,2，辛琦1,2，強麗媛1，程金平1,2,*

1. 華東師范大學河口海岸學國家重點實驗室，上海 200062 2. 香港城市大學深圳研究院，深圳 518057

近年來工業和養殖業中銅和四環素的濫用，導致了一定程度的水環境污染問題。為探究銅與四環素對水生生物的毒害作用，選擇斑馬魚作為受試生物，研究了銅及其與四環素的聯合暴露對斑馬魚胚胎的毒性效應，并進一步探索了其中可能的致毒機制。結果表明：銅在低濃度下(10%致死濃度LC10=2.5 μg·L-1，10%效應濃度EC10=0.1 μg·L-1)明顯延遲了斑馬魚胚胎的孵化、卵黃囊吸收、頭部、魚鰾和體長等生長指標的發育，同時在心臟區域引起了明顯的細胞凋亡效應。幼魚體內總銅含量檢測結果顯示低濃度下銅的生物利用度相對更高。基因表達結果顯示環境濃度的銅可能通過影響神經和心臟相關基因的表達引起斑馬魚胚胎的神經發育和心臟發育異常。銅和四環素的聯合暴露實驗結果表明二者的復合污染類型為拮抗作用，且兩者相互作用可以形成絡合物。綜合以上結論，說明環境濃度的銅可能通過細胞凋亡、分子水平的變化等方式對水生生物的早期生長發育產生危害，如延遲生長發育、神經及心臟發育異常，另外銅可通過和四環素等環境中其他污染物的結合改變銅的生物有效性和毒性。

銅；四環素；絡合物；斑馬魚胚胎；神經發育；心臟發育

銅是自然環境中大量存在的一種過渡元素。天然水體中的銅主要來自于工業、農業、生活廢水的污染和水產養殖飼料中高銅和魚藥硫酸銅的大量使用。在現代產業中，銅被廣泛應用于機械、電子、能源、石化和養殖等行業。據統計，2011年全球的精銅消費量為19.9百萬t，而中國的精銅消費量更是從2001年的2.2百萬t增長到2011年的7.8百萬t，年平均增長率約為13%[1]。如此大的消費量必然會日益增加自然環境的承載量。全球范圍內，銅在天然海水和淡水中的濃度水平分別為0.03～0.23 μg·L-1和0.20～30 μg·L-1[2]。近年在我國很多水環境中已檢測到高濃度銅的存在，如在渤海灣水域中最高濃度甚至能達到2.8 mg·L-1[3]。另外銅作為一種重金屬元素，它在生態系統中既不能被分解，也不能被消除[4]，所以沉積相中的銅也會成為水體中銅的污染源之一，導致銅的水體污染具有持久性，因此受到環境科學界的廣泛關注。

銅是許多酶類(如賴氨酰氧化酶、超氧化物歧化酶和細胞色素C氧化酶等)的主要構成成分之一[5]，所以它是水生動物必需的營養元素之一，但高濃度的銅將變成一種抑制物或毒性物質[6]，銅超過一定濃度就會成為環境污染物。因此調查銅在環境中的濃度和生物可利用性非常重要。生物體內的銅含量往往能較好地反映水環境中銅的污染程度。近年來有多篇文獻記載了我國多地牡蠣中的銅含量。Wang等[7]首次報道了我國的“藍牡蠣”現象，調查發現福建省九龍江口香港巨牡蠣(Crassostrea hongkongensis)的銅濃度為14.4 mg·g-1，肉組織呈現藍色。一般水環境中銅的存在形態包括溶解態(溶解于水中)和顆粒態(存在于懸移質中的懸移態及存在于表層沉積物中的沉積態)。溶解態的銅又可以以自由離子、顆粒態、有機物或無機離子的結合態存在，其中自由銅離子(Cu2+)被認為是毒性最強的形態。已有的毒理學研究表明一定濃度的銅離子會對水生生物產生毒害作用[8-9]。魚類早期發育階段(胚胎和仔、稚、幼魚)是對各種污染物最為敏感的階段之一[10]。較低劑量的銅離子就可抑制胚胎的發育[11]，且銅離子可穿過絨毛膜在胚胎內的不斷積累，對胚胎造成較強的致畸作用[12-14]，如胚胎尾巴彎曲、孵化失敗和胚胎死亡等[12]。大多數重金屬都有生殖毒性，銅也不例外。銅離子可以通過延緩性成熟[15]、降低受精率[16]、產卵量減少[17]等方式來抑制水生動物的繁殖。銅離子對斑馬魚胚胎早期發育的影響主要表現在抑制孵化、抑制生長發育和心率加快等方面[9]。但目前銅對水生生物的毒理機制研究還不完善，本文主要針對銅對魚類胚胎的毒性效應及其分子機制展開研究。

在天然水體環境中，顆粒態銅的存在形態可分為離子交換態、碳酸鹽結合態、鐵錳水合氧化物結合態、有機硫化物結合態及殘渣態，前3種形態對生物有潛在有效性，后2種不易被生物吸收利用。而水體中存在大量的陰離子配位體、膠體及有機顆粒，易與自由態的銅離子結合形成不易被生物吸收的形態[18]。在自然環境特別是水環境中，重金屬污染往往以復合污染的形式出現，復合污染的多樣性使得污染物的形態和毒性效應更為復雜。鑒于在養殖業中四環素也常作為治療藥物和飼料添加劑，我們通過文獻資料的調研，發現目前我國的部分水域中同時存在高濃度的溶解性銅和四環素。如在黃浦江水域，檢測出溶解性銅的濃度能達到22.9 μg·L-1[19]，并且四環素最高能達到1 000.0 μg·L-1[20]。因此，我們進一步研究了銅離子與四環素的復合污染。

現有的文獻研究也表明四環素類抗生素能夠抑制水生動物多種酶的活性，如乙氧基試鹵靈-O-去乙基酶、β-半乳糖苷酶等，并可能產生免疫毒性和基因毒性[21-23]，這說明四環素類抗生素對水生生物產生的環境效應不容忽視。此前也有研究表明，相比于銅的單一毒性，銅和四環素的聯合毒性變弱了[24]。但目前對此類復合污染的毒性研究還十分有限。本文選取斑馬魚胚胎作為模式生物開展了銅對斑馬魚胚胎的毒性機制研究及銅和四環素復合污染的初步探索。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗試劑和儀器

四環素(tetracycline，純度90%)購自上海邁瑞爾化學技術有限公司，CuSO4·5H2O(純度98%)、麻醉劑(tricaine)和RNA later試劑購于西格瑪奧爾德里奇公司，其他試劑(分析純)均購自于國藥集團化學試劑有限公司。

多功能光照培養箱(BSP-100，上海，上海博訊實業有限公司)、體視顯微鏡(SMZ168，廈門，Motic)、Leica熒光體視鏡(M165FC，德國，Leica)、實時熒光定量PCR儀(ABI-7500，美國，美國應用生物系統公司)。

1.2 斑馬魚胚胎的收集和急性暴露實驗設計

健康良好的野生型斑馬魚成魚購于花鳥市場。本次用于魚卵采集的成魚已在實驗室馴養3個月以上，光周期為14 h/10 h(晝/夜)。每天喂食豐年蝦幼蟲2次，每天清理殘餌和糞便。養殖水為充分曝氣、除氯24 h以上的自來水。水質條件為：pH(7±0.5)，溶解氧為(8±0.5) mg·L-1，硬度(230±0.5) mg·L-1(以CaCO3計)，水溫控制在(28±0.5) ℃。胚胎培養水(ISO 6341-1982)：稱取0.294 g CaCl2·2H2O，0.123 g MgSO4·7H2O，0.065 g NaHCO3和0.006 g KCl溶于充分曝氣的1 L去離子水中，作為實驗稀釋液和對照組實驗用水。選用飼養3個月以上的成魚用于產卵。在繁殖前1天，將雌魚和雄魚以1:2的比例放入孵化盒中。設定好開燈時間，第2天開燈30 min內斑馬魚產卵完成。用胚胎培養水沖洗胚胎，在體視鏡下挑取受精正常的胚胎用于暴露實驗。

斑馬魚胚胎毒性實驗根據斑馬魚實驗用書[25]進行。在體視顯微鏡下挑選受精后正常發育4 hpf(hours post-fertilization，hpf)的胚胎進行染毒實驗。本實驗選用的是12孔細胞培養板作為染毒器具，每個孔中盛4 mL的溶液和20顆正常發育的受精卵，每個濃度4個平行，共80枚胚胎，實驗重復3次。在預實驗基礎上，對四環素設置3個濃度(10，100，1 000 μg·L-1)，銅設置4個濃度(2.56 μg·L-1，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1，256 μg·L-1)。實驗過程中，銅單一毒性及其和四環素的聯合毒性暴露同時進行，濃度組成分別為0，銅(2.56 μg·L-1，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1，256 μg·L-1)，銅和四環素(2.56+10，2.56+100，2.56+1000；25.6+10，25.6+100，25.6+1000；128+10，128+100，128+1000；256+10，256+100，256+1000)μg·L-1。

為避免藥物因為光照而降解，將受試胚胎置于黑暗培養箱中，溫度為(28±1)℃。24 h更換1次溶液。暴露過程中的死亡胚胎和幼魚及時丟棄，避免對其他的胚胎和幼魚產生影響。暴露周期為96 hpf，記錄了24 hpf、48 hpf、72 hpf、96 hpf的死亡率、72 hpf孵化率。其中暴露96 hpf后的胚胎用0.016 mol·L-1的Tricaine進行麻醉，之后在顯微鏡下拍照，用于統計96 hpf的畸形率和表型。其中死亡率為死亡數與胚胎總數之比，孵化率為72 hpf的總孵化數與胚胎總數之比，用ImageJ軟件統計斑馬魚幼魚的體長、卵黃囊以及腦部面積。

1.3 暴露溶液和魚體內吸收的總銅含量分析

將暴露96 h后的斑馬魚幼魚用胚胎培養水清洗2次后，在體視鏡下將斑馬魚幼魚的頭部和軀干分開，收集進行稱重，然后參照文獻[26]的方法進行樣品的前處理。首先，用2 mL濃硝酸對斑馬魚進行消解2 h(180 ℃)，之后再加入1 mL的30% H2O2持續1 h(120 ℃)。然后在樣品中加入去離子水，使硝酸濃度稀釋到體積分數為2%，最后用ICP-MS(Element 2，美國，賽默飛世爾科技公司)檢測魚體內的總銅含量。在檢測暴露溶液中的銅元素前，應用孔徑為2.0 nm的超濾管進行過濾，以去除溶液中絡合物等形態的銅，過濾后的溶液中基本上都是銅離子，然后再應用ICP-MS進行檢測。

1.4 Acridine orange (AO)染色

本文應用AO染色來反映銅離子是否導致斑馬魚胚胎產生細胞凋亡，及產生細胞凋亡的區域。參考其他文獻的方法[27]，經過不同濃度的銅暴露96 h后，每個濃度隨機取10條幼魚，在質量百分比為30%的Danieau溶液(58 mmol·L-1NaCl, 0.7 mmol·L-1KCl, 0.4 mmol·L-1MgSO4, 0.6 mmol·L-1Ca(NO3)2, 5 mmol·L-1HEPES, pH 7.4)中清洗2次，再轉移到含有5 μg·mL-1AO的30%Danieau溶液中，在室溫下避光振蕩20 min。然后再于30% Danieau溶液中清洗3次，每次5 min。之后用0.016 mol·L-1的Tricaine麻醉胚胎3 min，然后用Leica熒光體視鏡進行細胞凋亡的檢測，有凋亡的細胞會呈現明顯的亮點。

1.5 基因表達分析

應用實時熒光定量RT-PCR技術研究了銅對斑馬魚在分子水平上是否影響神經和心臟發育相關基因的表達。96 hpf后收集保存于-20 ℃的RNA later中的胚胎，每個濃度有3個平行，每個平行20個胚胎。然后用Qiagen的RNA提取試劑盒(Qiagen，China Co., Ltd，上海，中國)提取總RNA，再用紫外熒光分光光度計(SMA4000，Merioton)進行總RNA濃度和質量檢測，參照說明書再使用反轉錄試劑盒(Takara，Dalian，Japan)合成cDNA。斑馬魚β-actin基因被選為參照基因進行實驗數據的歸一化。在NCBI官網上進行引物序列的設計(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)(表1)。使用實時熒光定量PCR儀(ABI-7500)進行實時定量PCR實驗。實驗數據用2-△△CT方法進行基因表達倍數的分析。

1.6 統計分析

用SPSS 17.0軟件 (SPSS, Chicago, IL, USA)計算EC10和LC10，顯著性分析之前用SPSS 17.0對數據進行方差齊次檢驗，然后用單因素方差分析(ANOVA)進行對照組和處理組的顯著性分析。百分比的數據先轉換為平方根的反正弦，再進行ANOVA分析。采用雙因子方差分析法來評價銅和四環素的聯合作用。當P<0.05時，說明2個因素具有協同或者拮抗作用。實驗數據用平均值(mean)±標準誤差(SEM)表示。當P<0.05時具有顯著性差異。用Graphpad Prism 5.0作圖。

2 結果(Results)

2.1 銅對斑馬魚胚胎生長發育的影響

生長發育相關指標的表型和數據如圖1和表2所示。96 h周期的實驗結果表明，與對照相比，濃度大于25.6 μg·L-1的銅可以顯著增加斑馬魚胚胎的死亡，其中在25.6 μg·L-1、128 μg·L-1和256 μg·L-1下的死亡率分別為31.5%、34.8%和46.7%。從亞致死效應方面來看，銅能夠顯著抑制斑馬魚胚胎的發育，主要表現在抑制孵化、體長、腦部發育、卵黃囊營養物質的吸收和魚鰾的生成等效應。當銅濃度達到2.56 μg·L-1就顯著抑制了這些生長指標的發育，其中孵化率在對照組能達到97.7%，而2.56 μg·L-1處理組的孵化率只有23.0%，更高濃度組沒有幼魚孵化。96 h正常發育的幼魚體長為3.8 mm，銅的4個濃度處理組的體長都顯著受到了抑制，分別為3.5，3.5，3.4，3.4 mm。另外，經銅處理后的幼魚的卵黃囊吸收明顯受到抑制，卵黃囊面積明顯比對照組大。銅的急性暴露結果表明，高于2.56 μg·L-1的銅顯著抑制了幼魚魚鰾的發育，256 μg·L-1處理組無魚鰾形成。有研究表明銅離子對斑馬魚胚胎的24 h的LC50為319.4 μg·L-1[28]，硫酸銅對斑馬魚成魚96 h的LC50為375.0 μg·L-1[29]。本文數據統計分析結果表明銅對斑馬魚胚胎的96 h的LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1。

表1 應用在本研究中的基因的引物序列Table 1 Gene and sequence of forward (Fw) and reverse (Rv) primers used in this study

圖1 銅處理96 hpf后，斑馬魚幼魚的表型圖

表2 銅對斑馬魚胚胎各指標的影響Table 2 Effects of Cu on the total mortality, hatching and morphologies of zebrafish embryos/larvae

注: a, 數值表示為平均值±標準偏差(n=4); b, 顯著性分析使用單因素方差分析(One-way ANOVA)，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001。

Note: a, All values were presented as the mean ± standard error; b, Significant differences between mean values were determined using one-way analysis of variance (ANOVA),*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

2.2 AO染色

AO染色是一種核酸染色技術，已有文獻表明AO染色可以反映細胞凋亡情況[27,30]。實驗結果表明：發育到96 hpf時，在正常胚胎中無明顯的凋亡信號，但是有大量的凋亡細胞出現在處理組的胚胎(銅，2.56，25.6和128 μg·L-1)的心臟區域(圖2b，2c，2d)。另外，還有少量的凋亡細胞集中在幼魚的尾部，尤其是在2.56 μg·L-1的銅處理組。

圖2 銅處理96 hpf后，斑馬魚幼魚的AO染色圖

2.3 斑馬魚幼魚體內總銅含量

ICP-MS的結果顯示包括對照組的所有幼魚體內都有檢測到銅的存在(圖3)，這可能是因為自然水體中也存在一定濃度的銅。魚體內總銅含量隨著銅暴露濃度的升高而增加，對照組幼魚體內總銅平均含量為0.08 μg·g-1，處理組分別為0.14，0.16，0.20，0.26 μg·g-1。其中，25.6 μg·L-1，128 μg·L-1和256 μg·L-1處理組的幼魚體內總銅含量有顯著性提高。然而，斑馬魚胚胎體內總銅含量并沒有隨暴露濃度的升高而成比例增加。即銅在較低濃度時生物可利用性相對更高，高濃度時雖然體內總量增多，但是吸收率反而較低。

斑馬魚幼魚不同部位的總銅含量如圖4所示。

圖3 暴露96 hpf后，幼魚體內總銅的檢測含量

圖4 斑馬魚胚胎暴露于Cu 96 hpf后，幼魚不同部位總銅的檢測含量

結果顯示，在銅處理組的幼魚的腦部和軀干部位的總銅含量是隨著銅暴露濃度升高而增加；在對照組和所有處理組的幼魚腦部的總銅的含量都比軀干部位要高，說明斑馬魚胚胎吸收銅后主要富集于腦部。

2.4 對胚胎神經和心臟發育相關基因的影響

斑馬魚胚胎早期發育的前96 hpf是斑馬魚神經和心臟發育的關鍵時期。從表型圖可以看出銅導致幼魚的頭部變小(圖1和表2)，而神經系統的發育是頭部發育過程中重要的組成部分，因此本文選取了神經發育相關基因來研究銅在分子水平上對斑馬魚胚胎神經發育的影響(圖5)。結果表明，Gfap基因在2.56 μg·L-1的銅處理組下的表達顯著被抑制，而在25.6 μg·L-1和128 μg·L-1下顯著上調表達；2.56 μg·L-1的銅顯著刺激了HuC基因的表達量；Ngn1基因在銅的低濃度組(2.56 μg·L-1和25.6 μg·L-1)下表達顯著上調。

圖5 銅暴露96 hpf后，斑馬魚胚胎神經和心臟發育相關基因的表達情況

在心臟發育方面，斑馬魚胚胎的心率加快[9]和心臟區域的細胞凋亡說明了銅可能導致斑馬魚胚胎心臟發育異常。基因表達結果也證實了銅可以顯著改變心臟相關基因的表達，25.6 μg·L-1的銅能顯著刺激Nkx2.5和Bmp2b基因的表達，而Gata5基因在銅所有濃度組都顯著下調了。

2.5 銅和四環素的聯合毒性效應及作用機制

銅和四環素的聯合暴露毒性數據如圖6顯示，死亡率(圖6a)的結果顯示，在沒有加入四環素時，256 μg·L-1的銅對斑馬魚胚胎96 h的死亡率為46.7%，但加入1 000 μg·L-1的四環素后，死亡率降低為36.7%。在孵化率方面(圖6b)，2.56 μg·L-1處理組的孵化率為23.0%，當加入不同濃度的四環素后，聯合暴露組的孵化率都顯著性地上升，分別為50.6%，63.9%和64.4%。其他指標如頭部面積和卵黃囊面積(圖6c,6d)方面，四環素的加入明顯在不同程度上顯著促進了這些指標的發育。

ICP-MS檢測結果顯示在聯合暴露組中，2.56、25.6和128 μg·L-1銅處理組的幼魚體內總銅含量并沒有受到四環素的影響，但已經顯示出總銅含量降低的趨勢，在銅的最高濃度組(256 μg·L-1)中，加入四環素(100 μg·L-1和1 000 μg·L-1)后顯著降低了幼魚體內吸收的總銅含量(圖7)。

利用雙因子方差對聯合暴露的數據分析后，本研究發現聯合暴露的毒性指標，如死亡率、孵化率、卵黃囊和頭部面積等效應都顯著低于銅的單獨暴露組(P<0.05)，斑馬魚幼魚體內吸收的總銅含量顯示了四環素的加入明顯降低了斑馬魚幼魚體內吸收的總銅含量，這些聯合暴露的數據表明四環素的加入明顯緩解了銅對斑馬魚胚胎的毒性，因此推測銅和四環素的復合污染效應屬于拮抗作用。已有文獻通過紅外光譜技術證實了土霉素和銅離子相互作用可以形成一種新的化學結構的絡合物[31]，我們根據聯合毒性的表型效應和幼魚體內吸收的總銅含量，推測銅離子和四環素相互作用可能形成如圖8所示的絡合物，而這種絡合物形態的銅降低了銅的生物可利用性，其毒性比銅離子的毒性要低。

為了驗證四環素和銅離子相互作用形成絡合物的假設，本文進一步檢測了銅的單獨及復合污染的生物可利用濃度(圖9)。檢測結果顯示2.56和25.6 μg·L-1的銅的暴露溶液中銅的實際濃度為3.8和24.8 μg·L-1，當加入100 μg·L-1的四環素后，兩者混合溶液中銅的實際濃度為2.3和21.9 μg·L-1，分別下降了44.2%和11.7%。聯合暴露溶液比銅的單獨暴露溶液中的銅濃度低，表明四環素明顯降低了銅的生物可利用濃度，即降低了溶液中的銅離子濃度，從而證實了四環素和銅相互作用形成了新的絡合物。并且檢測結果與聯合毒性的表型效應以及斑馬魚幼魚體內吸收的總銅含量是相吻合的。以孵化率為例，100 μg·L-1的四環素和2.56及25.6 μg·L-1銅的聯合暴露組的孵化率明顯比銅的單獨暴露組的孵化率要高。

3 討論(Discussion)

本研究選取了受精后4 h的斑馬魚胚胎用于銅的暴露試驗，在致死毒性方面，不同時間段的死亡率統計結果表明銅對胚胎的致死率在4～24 hpf時間段最高，因為此時間段是斑馬魚胚胎的原腸胚期和細胞分裂階段，相關研究表明此階段是魚類發育的關鍵期[32]，選取發育初期階段的斑馬魚胚胎用于水體污染物的毒性效應研究更為靈敏。

銅對斑馬魚胚胎的亞致死毒性效應方面，主要表現為孵化延遲、體長變短、卵黃囊吸收不全和魚鰾缺失等效應，本文的研究結果在其他文獻中也有報道[9,33]。孵化是斑馬魚胚胎發育過程中最明顯的發育指標之一，本文結果顯示2.56 μg·L-1的銅就可以明顯抑制斑馬魚胚胎的孵化。斑馬魚胚胎的孵化主要是由生物酶、滲透作用和機械過程的結合導致的[34]，因此銅引起的孵化延遲和失敗可能是這些機制中的一個或多個導致的。卵黃囊是斑馬魚胚胎前期發育的唯一營養來源，一般卵黃囊體積是隨著胚胎的發育而減小的，當斑馬魚胚胎卵黃囊中的營養吸收受到影響后，就會抑制斑馬魚胚胎的發育，本文的結果顯示環境濃度的銅可以顯著抑制斑馬魚的營養吸收，卵黃囊的面積明顯比正常發育胚胎的卵黃囊大。魚鰾在斑馬魚胚胎發育過程中對斑馬魚游泳和保持平衡方面起著很重要的作用[35]。在本研究中，環境濃度的銅明顯抑制了斑馬魚胚胎魚鰾的形成。本研究統計以上毒性數據分析得到銅對斑馬魚胚胎的96 h-LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1，再結合環境中銅的濃度，說明目前水環境中存在的銅可以影響較為敏感的小型魚類早期的生長發育，并可能對水生生態系統產生一定的風險。而ICP-MS的結果說明我們需要進一步研究污染物對生物體的生物有效濃度和生物利用度，這對于明確污染物安全濃度是非常重要的。

圖6 銅與四環素的聯合毒性表型效應

此前已有文獻表明銅可以導致斑馬魚成魚的魚鰓產生細胞凋亡，并推測出可能的細胞凋亡信號通路[36]。本文中應用AO染色對銅是否對斑馬魚早期發育產生細胞凋亡進行了研究，結果顯示，環境濃度的銅可以對斑馬魚胚胎產生細胞凋亡，主要集中于心臟區域，說明了細胞凋亡是銅對斑馬魚產生毒性的主要途徑之一，而心臟可能是銅對斑馬魚產生毒性的潛在靶標位置。相關研究還表明銅可以導致斑馬魚胚胎心率在28 hpf時加快[9]，并在120 hpf時會減少斑馬魚幼魚的功能性神經丘(functional neuromasts)生成，而這一功能的缺失將會導致斑馬魚胚胎早期的定位能力下降[9]。根據上述結果，我們推測銅會影響斑馬魚胚胎的神經和心臟發育。本研究中的表型數據也表明銅會導致斑馬魚幼魚的頭部變小，而頭部發育和神經系統發育有直接聯系。在此基礎上，進一步應用RT-PCR對心臟和神經發育相關基因的表達進行了驗證。在神經系統發育過程中，Gfap和Ngn1對于中胚層細胞向神經細胞分化、神經系統細胞的形成和成熟、大腦皮層的發育等過程十分關鍵[37-38]。HuC屬于RNA結合蛋白家族，對于神經系統早期發育十分重要，在神經分化和成熟過程中扮演重要角色，其可通過增加mRNA的穩定性而對神經細胞的功能有維持作用[39]。結果證實，低濃度(2.56～256 μg·L-1)的銅可以提高Gfap、HuC和Ngn1基因的表達量，說明環境濃度的銅可能通過影響神經發育相關基因的表達對斑馬魚胚胎造成了部分神經發育的損害。在心臟發育過程中，Nkx2.5在心臟傳導系統、心房形成等方面起著重要作用[40]。在斑馬魚中，Gata5和Bmp2b是Nkx2.5的上游基因，本研究中低濃度銅的處理組(2.56和25.6μg·L-1)導致了Gata5的下調，但Bmp2b沒有顯著變化，這說明銅可能通過Gata5基因來調控Nkx2.5的表達，而Nkx2.5的表達量上升表明銅可能影響了斑馬魚胚胎的心臟發育。這與芘(pyrene)導致的心臟毒性機制類似[41]。我們推測銅最終通過上調Nkx2.5基因表達從而引起了心臟發育異常，心率的改變可能和這些基因變化有關，這有待于后續研究的證實。

圖7 銅與四環素聯合暴露斑馬魚胚胎96 hpf后，幼魚體內的總銅含量

圖9 單一銅溶液以及銅和四環素的混合溶液中銅的檢測濃度

圖8 銅離子與四環素可能形成的絡合物的化學結構圖

在自然環境因素中，銅對水生生物的毒性以及生物有效性取決于銅的濃度及形態。在所有形態中，自由離子態銅的毒性最強，而絡合態或其他吸附形態的銅的毒性均比離子態銅的毒性低[42]。已有研究表明土霉素和銅離子形成一定結構的絡合物[31]，鑒于土霉素和四環素化學結構類似，所以我們推測銅離子和四環素相互作用可能形成如圖8所示化學結構的絡合物形態，這種形態銅的毒性要比銅離子要低，且不易被生物體吸收，即降低了銅的生物可利用濃度。銅的暴露溶液及四環素和銅的混合溶液中銅的檢測濃度證實了四環素和銅離子相互作用產生絡合物的假設。另外聯合暴露得到的表型指標，如死亡率、孵化率、卵黃囊面積等(圖5)，也表明銅離子與一定量的四環素結合可以緩解銅對斑馬魚胚胎的毒性。而斑馬魚幼魚體內總銅檢測含量顯示，聯合暴露的幼魚體內的總銅含量要比單獨暴露的幼魚體內的總銅含量要低，進一步說明四環素與銅的聯合暴露可能降低了銅的生物可利用性。利用雙因子方差分析法來評價銅和四環素的聯合作用類型，最終結果顯示銅和四環素的復合污染環境效應屬于拮抗作用。

綜上所述，本文研究結果表明：1)環境濃度的銅(2.56、25.6、128和256 μg·L-1)對斑馬魚胚胎的亞致死效應主要為延遲胚胎的生長發育，表現在孵化延遲、體長變短、頭部變小、卵黃囊吸收不全、魚鰾缺失等方面；銅對斑馬魚胚胎96 h的LC10和EC10分別為2.5 μg·L-1和0.1 μg·L-1。2)AO染色試驗表明銅可以誘導斑馬魚的心臟區域產生細胞凋亡。3)基因表達分析表明環境濃度的銅可能通過影響神經和心臟相關基因的表達引起斑馬魚胚胎的神經發育和心臟發育異常。4)斑馬魚幼魚對不同濃度銅的生物有效吸收并不相同，且低濃度銅的生物有效性更高，需更加重視低濃度銅導致的環境效應。5)聯合暴露數據表明四環素可以緩解銅對斑馬魚胚胎的毒性，兩者的復合污染效應為拮抗作用。6)四環素和銅相互作用形成一種絡合物,降低了銅離子的生物有效濃度和毒性。

[1] 潘科, 朱艾嘉, 徐志斌, 等. 中國近海和河口環境銅污染的狀況[J]. 生態毒理學報, 2014, 9(4): 618-631

Pan K, Zhu A J, Xu Z B, et al. Copper contamination in coastal and estuarine waters of China [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2014, 9(4): 618-631 (in Chinese)

[2] Flemming C, Trevors J. Copper toxicity and chemistry in the environment: A review [J]. Water, Air, and Soil Pollution, 1989, 44(1-2): 143-158

[3] Xu L, Wang T Y, Ni K, et al. Metals contamination along the watershed and estuarine areas of southern Bohai Sea, China [J]. Marine Pollution Bulletin, 2013, 74(1): 453-463

[4] Pujin V, Djukie N, Maletin S, et al. Content of heavy metals in some fish species in the section of the Danube flowing through Voiv dina [J]. Water Science & Technology, 1990, 22(5): 79-85

[5] Stohs S J, Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions [J]. Free Radical Biology Medicine, 1995, 18(2): 321-336

[6] De Boeck G, Meeu W, De Coen W, et al. Tissue-specific Cu bioaccumulation patterns and differences in sensitivity to waterborne Cu in three freshwater fish: Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss), common carp (Cyprinus carpio) and gibel carp (Carassius auratus gibelio) [J]. Aquatic Toxicology, 2004, 70(3): 179-188

[7] Wang W X, Yang Y, Guo X, et al. Copper and zinc contamination in oysters: Subcellular distribution and detoxification [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2011, 30(8): 1767-1774

[8] Abdel-Tawwab M, Mousa M A A, Abbass F E. Growth performance and physiological reponse of African catfish,Clarias gariepinus (B.) fed organic selenium prior to the exposure to environmental copper toxicity[J]. Aquaculture, 2007, 272(1-4): 335-345

[9] Johnson A, Carew E, Sloman K A. The effects of copper on the morphological and functional development of zebrafish embryos [J]. Aquatic Toxicology, 2007, 84(4): 431-438

[10] Westernhagen von H. Sublethal effects of pollutants on fish eggs and larvae[D]. New York, USA: Academic Press, 1988: 253-234

[11] 姚紀花, 周平凡. 銅、鋅和甲胺磷對大鱗副泥鰍胚胎發育和仔魚成活的影響[J]. 上海水產大學學報, 1997, 6(1): 11-16

Yao J H, Zhou P F. Effects of copper, zinc and methamidophos on the embryo development and larva survival of loach Paramisgurns dabyanus sauage [J]. Journal of Shanghai Fisheries University, 1997, 6(1): 11-16 (in Chinese)

[12] 柳敏海, 陳波, 羅海忠. 五種重金屬對早繁鮸魚胚胎和仔魚的毒性效應[J]. 海洋漁業, 2007, 29(1): 57-62

Liu M H, Chen B, Luo H Z. Toxic effects of five heavymetals on the embryos and larvae of Miichthys miiuyBasilewsky during early developing stages [J]. Marine Fisheries, 2007, 29(1): 57-62 (in Chinese)

[13] 吳鼎勛, 洪萬樹. 四種重金屬對鮸狀黃姑魚胚胎和仔魚的毒性[J]. 臺灣海峽, 1999, 18(2): 186-190

Wu D X, Hong W S. Study on toxicity of four heavy metals to embryo and larval of Nibea miichthioides [J]. Journal of Oceangraphy in Taiwan Strait, 1999, 18(2): 186-190 (in Chinese)

[14] 柳學周, 徐永江, 蘭功剛. 幾種重金屬離子對半滑舌鰨胚胎發育和仔稚魚的毒性效應[J]. 海洋水產研究, 2006, 27(2): 33-42

Liu X Z, Xu Y J, Lan G G. Toxic effects of several heavy metals on the embryos, larvae of Cynoglossus semilaevis Günther [J]. Marine Fisheries Research, 2006, 27(2): 33-42 (in Chinese)

[15] Koivisto S, Ketola M. Effects of copper on life-history traits of Daphnia pulex and Bosmina longirostris [J]. Aquatic Toxicology, 1995, 32(2/3): 255-269

[16] Reichelt-Brushett A J, Harrison P L. The effect of selected trace metals on the fertilization success of several scleractinian coral species [J]. Coral Reefs, 2005, 24: 524-534

[17] Garnacho E, Tyler P A, Peck L S. Reproduction, seasonality, and copper toxicity in the coastal mysid Praunus flexuosus [J]. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 2001, 81: 433-440

[18] Sadiq M. Toxic Metal Chemistry in Marine Environments [M]. 1992

[19] 王紅艷, 郜洪文, 周丹紅. 氯磺酚偶氮羅丹寧分光光度法測定天然水中痕量銅(Ⅱ) [J]. 光譜實驗室, 2010, 27(3): 1172-1177

Wang H Y, Hao H W, Zhou D H. Determination of trace amounts of copper (II) in natural water by spectrophotometry with sulfochlorophenolazorhodanine [J]. Chnese Journal of spectroscopy Laboratory, 2010, 27(3): 1172-1177 (in Chinese)

[20] 沈群輝, 冀秀玲, 傅淑珺, 等. 黃浦江水域抗生素及抗性基因污染初步研究 [J]. 生態環境學報, 2012, 21(10): 1717-1723

Shen Q H, Ji X L, Fu S J, et al. Preliminary studies on the pollution levels of antibiotic and antibiotic resistance genes in Huangpu River, China [J]. Ecology and Environmental Sciences, 2012, 21(10): 1717-1723 (in Chinese)

[21] Lunden T, Miettinen S, Lonnstroml L G, et al. Influence of oxytetracycline and oxolinic acid on the immune response of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss ) [J]. Fish & Shellfish Immunology, 1998, 8(3): 217-230

[22] 曲甍甍, 孫立偉, 陳鋆, 等. 獸藥添加劑阿散酸和土霉素的毒理學研究 [J]. 農業環境科學學報, 2004, 23(2): 240-242

Qu M M, Sun L W, Chen J, et al. Toxicological characters of arsanilic acid and oxytetracycline [J]. Journal of Agro-Environment Science, 2004, 23(2): 240-242 (in Chinese)

[23] 李兆利, 陳海剛, 徐韻, 等. 3種獸藥及飼料添加劑對魚類的毒理效應 [J]. 生態與農村環境學報, 2006, 22(1): 84-86

Li Z L, Chen H G, Xu Y, et al. Toxicological effects of three veterinary drugs and feed additives on fish [J]. Journal of Ecology and Rural Environment, 2006, 22(1): 84-86 (in Chinese)

[24] 劉臻. 典型抗生素對熱帶爪蟾胚胎生態毒性的研究 [D]. 上海: 上海海洋大學, 2012

Liu Z. Ecological toxicity of selected antibiotics on the embryo of Xenopus tropicalis [D]. Shanghai: Shanghai Marine University, 2012 (in Chinese)

[25] Westerfield M. The Zebrafish Book [M]. Eugene: University of Oregon Press, 1993

[26] Griffitt R J, Lavelle C M, Kane A S, et al. Chronic nanoparticulate silver exposure results in tissue accumulation and transcriptomic changes in zebrafish [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 130: 192-200

[27] Zeng C, Sun H, Xie P, et al. The role of apoptosis in MCLR-induced developmental toxicity in zebrafish embryos [J]. Aquatic Toxicology, 2014, 149: 25-32

[28] 張亞輝, 劉征濤, 王一喆, 等. Cu2+和Cd2+對斑馬魚胚胎早期發育的聯合毒性 [J]. 環境科學研究, 2010, 23(11): 1415-1420

Zhang Y H, Liu Z T, Wang Y Z, et al. Joint toxicity of Cu2+and Cd2+to early development of zebrafish embryos [J]. Research of Environmental Science, 2010, 23(11): 1415-1420

[29] 張麗玉. 重金屬銅對斑馬魚的急性毒理試驗[D]. 漳州: 漳州師范學院, 2004

[30] Yuan G G, Wang Y M, Yuan X Y, et al. T-2 toxin induces developmental toxicity and apoptosis in zebrafish embryos [J]. Journal of Environmental Sciences, 2014, 26(4): 917-925

[31] Zhang Y, Cai X Y, Lang X M, et al. Insights into aquatic toxicities of the antibiotics oxytetracycline and ciprofloxacin in the presence of metal: Complexation versus mixture [J]. Environmental Pollution, 2012, 166: 48-56

[32] Luckenbach T, Kilian M, Triebakorn R, et al. Fish early life stage tests as a tool to assess embryo toxic potentials in small streams [J]. Journal of Aquatic Ecosystem Stress Recovery, 2001, 8: 355-370

[33] Zhang W, Miao Y, Lin K, et al. Toxic effects of copper ion in zebrafish in the joint presence of CdTe QDs [J]. Environmental Pollution, 2013, 176: 158-164

[34] Yamagami K. Mechanisms of hatching in fish: Secretion of hatching enzyme and enzymatic choriolysis [J]. American Zoologist, 1981, 21(2): 459-471

[35] J?nsson M E, Kubota A, Timme-Laragy A R, et al. Ahr2-dependence of PCB126 effects on the swim bladder in relation to expression of CYP1 and cox genes in developing zebrafish [J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2012, 265(2): 166-174

[36] Luzio A, Monteiro S M, Fontaínhas-Fernandes A A, et al. Copper induced upregulation of apoptosis related genes in zebrafish (Danio rerio) gill [J]. Aquatic Toxicology, 2013, 128-129: 183-189

[37] Tropepe V, Sive H L. Can zebrafish be used as a model to study the neurodevelopmental causes of autism? [J]. Genes Brain and Behavior, 2003, 2: 268-281

[38] Barres B A. The mystery and magic of glia: A perspective on their roles in health and disease [J]. Neuron, 2008, 60: 430-440

[39] Wilson S I, Edlund T. Neural induction: Toward a unifying mechanism [J]. Nature Neuroscience, 2001, 4: 1161-1168

[40] Pashmforoush M, Lu J T, Chen H, et al. Nkx2-5 pathways and congenital heart disease; loss of ventricular myocyte lineage specification leads to progressive cardiomyopathy and complete heart block [J]. Cell, 2004, 117: 373-386

[41] Zhang Y Y, Wang C G, Huang L X, et al. Low-level pyrene exposure causes cardiac toxicity in zebrafish (Danio rerio) embryos [J]. Aquatic Toxicology, 2012, 114-115: 119-124

[42] Huang T C, Chuang A, Wu S J, et al. Relationships among the species and forms of copper and biomass along the Erhjin Chi coastal water [J]. Acta Oceanographica Taiwanica, 1990, 25: 65-76

◆

Developmental Toxicity of Cu and Tetracycline on Zebrafish Embryos (Daniorerio)

Zhang Qiang1,2, Xin Qi1,2, Qiang Liyuan1, Cheng Jinping1,2,*

1. State Key Laboratory of Estuarine and Coastal Research, East China Normal University, Shanghai 200062, China 2. City University of Hong Kong Shenzhen Research Institute, Shenzhen 518057, China

Received 26 December 2014 accepted 30 April 2015

With the increase use of copper and tetracycline in industry and agriculture, their aquatic environmental concentration increased greatly in recent years. This study aims to examine the developmental toxicity of Cu and tetracycline on zebrafish embryos (Danio rerio) and further explore its molecular mechanism. Cu shows high toxicity to zebrafish embryos (LC10=2.5 μg·L-1, EC10=0.1 μg·L-1), retarding the development and inducing apoptosis in the heart area of zebrafish larvae. The in vivo uptake of total Cu (96 h) in exposed embryos suggests that the uptake rate is relatively higher in low concentrations as compared to that of high concentrations. Gene expression study results showed that exposure to Cu upregulated gene expression level of Nkx2.5, which is responsible to cardiac development in zebrafish larvae. Exposure to Cu affected the gene expression level of several neuron development governing genes selected in this study. The results obtained in the co-exposure to Cu and tetracycline suggest that the combined toxicity is antagonism. This study suggests that exposure to Cu inhibits embryonic growth, induces the developmental anomaly of the nervous and heart in zebrafish embryos at environmental relevant concentrations. Co-exposure of Cu with other environmental contaminants such as tetracycline can change the bioavailability and the associated toxicity of Cu in aquatic organisms.

Cu; tetracycline; complex; zebrafish embryos; neurodevelopment; cardiac development

國家自然科學基金(41101489)；廣東省自然科學基金(s2012010010847)；教育部新世紀優秀人才計劃項目(NECT-12-0181)； 河口海岸學國家重點實驗室自主課題(2012RCDW-01)

章強(1990-)，男，碩士研究生，研究方向為環境毒理學，E-mail: zzggkobe@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jinpingcheng@gmail.com

10.7524/AJE.1673-5897.20141226001

2014-12-26錄用日期：2015-04-30

1673-5897(2015)5-035-12

X171.5

A

程金平(1978-)，女，博士，研究員，主要研究方向為生態毒理學。

章強，辛琦，強麗媛, 等. 銅及其與四環素的聯合暴露對斑馬魚胚胎的毒性效應研究[J]. 生態毒理學報，2015, 10(5): 35-46

Zhang Q, Xin Q, Qiang L Y, et al. Developmental toxicity of Cu and tetracycline on zebrafish embryos (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(5): 35-46 (in Chinese)