武漢市乙型肝炎病毒基因型分布和P區耐藥突變模式及兩者相關性分析*

崔 艷，李 艷，喬 斌，汪 明

(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

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·論 著·

武漢市乙型肝炎病毒基因型分布和P區耐藥突變模式及兩者相關性分析*

崔 艷，李 艷△，喬 斌，汪 明

(武漢大學人民醫院檢驗科，武漢 430060)

目的 探討武漢地區乙型肝炎病毒(HBV)基因型的分布情況和P區耐藥突變模式及兩者的相關性。方法 提取HBV-DNA進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增后以直接測序法檢測HBV基因型及P區耐藥突變位點，用SPSS19.0軟件進行統計學分析。結果 219例慢性乙型肝炎患者血漿中檢出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。對202例分出基因型的標本進行耐藥突變檢測，其中76例發生耐藥突變，突變位點以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多見。YMDD突變的發生率在B、C基因型之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，但YMDD突變類型中的M204V和M204I在B、C基因型中的分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。結論 武漢地區HBV基因型以B型和C型為主，HBV耐藥突變以M204I、M204V、L180M多見，臨床醫生應根據基因分型和耐藥突變結果為慢性乙型肝炎患者選擇適合的治療方案。

乙型肝炎病毒； 基因型； 耐藥突變； 核苷(酸)類似物

乙型肝炎病毒(HBV)基因型包括A～H,不同地區的分布特征可能存在差異，我國以B、C型常見，還有少量D型。基因型是影響HBV感染結果的主要決定因素之一，不同基因型的致病性有所差異，并且與臨床表現、預后、治療應答均有一定的關系[1]。目前，臨床應用最廣泛的抗HBV藥物為核苷(酸)類似物，但由于長期及不規范用藥，使HBV產生耐藥突變，影響了治療效果。因此，本研究進行HBV基因型分型及耐藥變異檢測，以期為臨床醫生合理用藥提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 219例血漿標本均來自本院2011年4月至2014年4月門診及住院部的慢性乙型肝炎患者，年齡18～76歲，其中男183例，女36例。慢性肝炎的診斷標準符合中華醫學會肝病學分會和感染病學分會于2010年更新的《慢性乙型肝炎防治指南》[2]。所有患者血漿丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)等檢測均為陰性。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 HBV-DNA提取采用上海萊楓生物科技有限公司生產的體液游離DNA微量提取試劑盒，提取過程嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.2.2 HBV基因分型及耐藥突變檢測 對待檢血漿標本中提取的HBV-DNA進行Pol基因RT區核酸聚合酶鏈反應(PCR)擴增后直接測序，測序引物為上海生工合成，上游引物為5′-TGG ACT TCT CTC AAT TTT CT-3′，下游引物為5′-TGA CAG ACT TTC CAA TCA AT-3′，采用美國ABI公司3500測序儀及其配套試劑檢測，并將所測序列與美國國立生物技術信息中心(NCBI)核酸序列數據庫(GenBank)中HBV-DNA Pol基因RT區參考序列AF100309、AB014381和X51970等進行比對分析，確定受檢血漿標本中HBV-DNA的基因型，以及所檢測區域是否發生耐藥突變和其耐藥突變類型。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理與統計學分析，計數資料以例數、頻次或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 HBV-DNA基因型分布及耐藥分布 219例慢性乙型肝炎患者血漿中共檢出HBV基因型B型135例(61.6%)、C型61例(27.9%)、D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)及B+F+G混合型1例(0.4%)、未分型17例(7.8%)。B基因型標本中50例發生耐藥突變，C基因型標本中26例發生耐藥突變，B、C基因型耐藥突變發生率比較差異無統計學意義(χ2=3.609，P=0.057)。HBV耐藥突變檢測結果見圖1。

圖1 HBV耐藥突變檢測結果

2.2 HBV耐藥模式分布 對202例基因分型標本中HBV-DNA的P區進行測序，其中12例沒有發生突變，113例發生的突變尚不確定與核苷(酸)類似物耐藥相關，76例明確發生耐藥突變。與耐藥相關的單個氨基酸突變模式見表1。

表1 HBV單個氨基酸突變模式結果

表2 HBV YMDD突變與基因型的關系

表3 HBV YMDD突變類型與基因型的關系

2.3 YMDD突變與基因型之間的關系 B基因型和C基因型YMDD突變的發生率比較，差異無統計學意義(χ2=1.783,P=0.182)；而YMDD突變類型中的M204V和M204I在B、C兩種基因型中的分布比較差異有統計學意義(χ2=6.01,P=0.014)。見表2～3。

3 討 論

HBV基因型分布呈現一定的地區差異性，其中A基因型主要分布在歐洲西部、北部及非洲撒哈拉沙漠地區；B、C型主要分布在遠東東部和亞洲南部；D型的分布較廣，常見于地中海地區及近東地區,同時在亞洲少數地區也有發現；E型主要在非洲撒哈拉沙漠地區；F型主要分布在美國[3]。本研究顯示，武漢市慢性乙型肝炎患者的基因型以B型(61.6%)為主，其次為C型(27.9%)，這一結果符合我國HBV基因型南方以B型為主、北方以C型為主的分布特征[4-5]。此外，在本次研究中還發現了在我國較少見的幾種基因型，其中D型2例(0.9%)、B+C混合型3例(1.4%)、B+F+G混合型1例(0.4%)，由此可見武漢市HBV基因型分布有復雜化的趨勢。臨床上進行HBV基因分型檢測具有相當重要的意義，與B基因型相比，C基因型的HBV感染更易發生重癥肝病、肝硬化、肝癌等肝臟疾病。此外，C基因型HBV感染者的乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性率較高，病毒復制活躍，免疫清除比較晚，不易發生HBeAg血清轉化[1]。而且，不同基因型的HBV對抗病毒治療藥物的反應有著十分大的差異，總體上B基因型比C基因型易治療[6]。

目前已明確有抗HBV效果的藥物包括核苷(酸)類似物及α干擾素，其中以核苷(酸)類似物應用最為廣泛。但由于核苷(酸)類似物的長期應用及不規范用藥，使HBV產生耐藥突變，影響了治療效果。因此，定期進行HBV耐藥變異相關檢測對指導臨床醫生用藥具有相當重要的意義。我國慢性乙型肝炎抗病毒治療專家委員會認為采用核苷(酸)類似物來進行長期治療的關注點在于選擇性耐藥位點的出現，治療期間至少應該每3個月進行一次HBV-DNA耐藥變異檢測[7]。

本研究中，76例標本檢出有核苷(酸)類似物相關耐藥變異，突變位點以M204I(42.9%)、M204V(22.1%)、L180M(27.3%)多見，其中M204I/V位點的變異與拉米夫定、替比夫定、恩替卡韋的耐藥相關。L180M位點的變異常引起拉米夫定、替比夫定、恩曲他濱、恩替卡韋發生耐藥。A181T/V、N236T、L80I/V、V84M等位點的變異與阿德福偉的耐藥有關，其中A181T位點突變較為特殊，除了可引起拉米夫定、替比夫定、阿德福韋的非典型耐藥以外，還影響S蛋白的表達分泌[8]。此外，rtA181位點變異被認為是多藥耐藥的標志，此位點的變異除了導致阿德福韋耐藥外，還可引起替諾福韋、拉米夫定和替比夫定耐藥[8]，有文獻建議臨床上治療rtA18l位點突變的患者應該采用替諾福韋與恩替卡韋聯合用藥的治療方案[9]。

YMDD變異是HBV對拉米夫定最常見的耐藥變異模式。耐藥基因位點YMDD位于聚合酶的C區(rtM204I或rtM204V)，分別是YMDD中的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)或纈氨酸(V)所取代，形成YIDD或YVDD變異，這兩種變異分別是HBV基因組第739位堿基腺嘌呤(A)被鳥嘌呤(G)替代和第741位堿基鳥嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)替代[10-11]。本研究分析了拉米夫定經典耐藥中的YMDD突變與基因型的關系，以及YMDD突變類型與基因型的關系。分析顯示，YMDD的發生在B、C基因型之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，而YMDD中的M204I、M204V在B、C基因型中的分布比較差異有統計學意義(P<0.05)。YMDD突變比例隨著服藥時間的延長而增加，服用拉米夫定第1、2、3、4年的耐藥發生率分別為14%、38%、49%和66%[12]。也有文獻表明YMDD突變的發生率可能與HBeAg和HBV-DNA水平具有相關性[13-14]。

綜上所述，臨床醫生在治療慢性乙型肝炎時應結合HBV基因分型和耐藥突變模式及其他檢測結果制訂出合理的治療方案，從而達到理想的治療效果。

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Distribution of genotypes of hepatitis B virus in Wuhan and P region drug resistance mutation patterns and their correlation analysis*

CUIYan,LIYan△,QIAOBin,WANGMing

(DepartmentofClinicalLaboratory,People′sHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430060,China)

Objective To study the distribution of hepatitis B virus(HBV) genotypes and its correlation with the mutation patterns in the P region of HBV.Methods HBV DNA was extracted for conducting PCR.Then the HBV genotypes and P region drug resistance mutation sites were detected by using the direct sequencing method and the detection results were statistically analyzed by using the SPSS 19.0 software.Results Among 219 patients with chronic hepatitis B,135 cases(61.6%) of HBV genotype B,61 cases(27.9%) of genotype C,2 cases (0.9%) of genotype D,3 cases (1.4%) of genotype B+C,1 case(0.4%) of genotype B+F+G and 17 cases (7.8%) of undefined genotype were detected out.Among them,76 cases developed the drug resistance mutation,the mutation sites were mainly M204I(42.9%),M204V(22.1%) and L180M(27.3%).The occurrence rate of YMDD mutation had no statistically significant difference between the gynotype B and C (P>0.05).But in the YMDD mutation patterns,M204I and M204V had statistical difference in the distribution of C and D genotypes(P<0.05).Conclusion The HBV genotypes in Wuhan are mainly genotype B and C.The major drug resistant mutations are M204I,M204V and L180M.Clinical doctors should select the proper therapeutical scheme for treating chronic hepatitis B based on the results of the genotyping and drug-resistant mutations.

hepatitis B virus； genotype; drug-resistant mutation； nucleos(t)ide analogues

國家重點臨床專科建設項目(財社【2010】305號)。

崔艷，女，在讀研究生，主要從事分子診斷研究。△

，E-mail：yanli.1120@hotmail.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.001

A

1672-9455(2015)05-0577-03

2014-11-05

2014-12-16)