酶聯免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒血清學標志物的性能評價*

盧 婷，李發科，羅 杰，楊邵俊，潘 鋒，章明徐,陳 鳴

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042)

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·論 著·

酶聯免疫吸附試驗檢測乙型肝炎病毒血清學標志物的性能評價*

盧 婷，李發科，羅 杰，楊邵俊，潘 鋒，章明徐,陳 鳴△

(第三軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所檢驗科，重慶 400042)

目的 通過檢測乙型肝炎病毒(HBV)血清學標志物，對ADDCAER1100全自動酶免工作站進行定性試驗的性能評價。方法 根據美國臨床實驗室標準化協會(NCCLS)頒布的EP12-A文件，以Architect I2000全自動化學發光免疫分析儀(簡稱Architect I2000)為參考方法，對ADDCAER1100全自動酶免工作站(簡稱ADDCAER1100)進行HBV血清學標志物檢測的方法學對比及重復性試驗，完成其定性試驗的性能評價。結果 方法學比較顯示，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的總符合率分別為99.0%、99.5%、99.5%、98.0%、100.0%；陽性符合率分別為98.0%、100.0%、99.0%、97.0%、100.0%，陰性符合率分別為100.0%、99.0%、100.0%、99.0%、100.0%，Kappa系數分別為0.98、0.99、0.99、0.96,1.00。重復性試驗顯示，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb±20%濃度的臨界值樣本陽(陰)性率均不小于95%，95%置信區間分別為：96.6%～99.5%、97.6%～99.5%、97.6%～99.5%、94.7%～99.5%、98.6%～99.5%。結論 ADDCAER1100與Architect I2000檢測HBV血清學標志物的結果一致性較強，ADDCAER1100檢測HBV血清學標志物在臨界值±20%的濃度內能得到穩定結果。該儀器的性能可靠，可用于標本的檢測。

酶聯免疫吸附試驗； 定性試驗； 性能評價； 乙型肝炎病毒； 血清學標志物

我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發國家，現有慢性HBV感染者約9 300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2 000萬人[1]。臨床試驗室已開展了多種HBV血清學標志物的檢測方法，其中化學發光法是定量檢測HBV血清學標志物的高靈敏度和高特異性的方法。以酶聯免疫吸附試驗(ELISA)為代表的定性方法因具有靈敏度和特異性高、操作簡便、經濟等優點，也一直是臨床試驗室檢測HBV抗原、抗體的常用方法，同時是各級醫院檢驗科的必備方法。ADDCAER1100全自動酶免工作站是一種基于ELISA的全自動血清標志物定性檢測平臺，其HBV血清學標志物檢測性能未知。本研究根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)文件EP12-A，結合臨床試驗室實際情況，以HBV血清學標志物乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗體(HBsAb)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、乙型肝炎e抗體(HBeAb)、乙型肝炎核心抗體(HBcAb)測定為例，以Architect I2000全自動化學發光免疫分析儀為參考方法，對ADDCAER1100全自動酶免工作站進行性能評價，通過重復性試驗和方法學對比評價該系統的檢測性能[2]，以保證臨床標本檢測的準確性和可靠性。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集2012年12月至2013年5月本院門診、病房和體檢檢測HBV血清學標志物的血清標本1 000例，包括5種HBV血清學標志物(HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb)的陽性和陰性標本各100例。

1.2 試劑和儀器 采用儀器為煙臺艾德康ADDCAER1100全自動酶免工作站，配套試劑為北京萬泰生產的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的ELISA試劑盒；美國雅培Architect I2000全自動化學發光免疫分析儀及其配套試劑、定標品。質控品為衛生部臨檢中心提供的0.2 IU/mL HBsAg、30 IU/mL HBsAb、2 NCU/mL HBeAg、4 NCU/mL HBeAb、4 NCU/mL HBcAb的質控血清。

1.3 方法

1.3.1 方法學的對比 參考EP12-A文件設計試驗方案，以 Architect I2000為參考方法，ADDCAER1100為對比方法。分別選取HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb陽性和陰性標本各100份，用以上兩臺設備進行檢測，方法學比較在10 d內完成，按照受試者血清標本進行檢測。每次試驗低值質控品重復檢測2次，總共檢測20次，任何一次低值質控品失控，立即停止試驗，該批標本檢測數據視為無效，應在當天或第2天重新測量，最后比較兩套檢測方法結果的一致性。

1.3.2 重復性試驗 參考EP12-A文件設計試驗方案，每次試驗均設立陰陽性對照(試劑盒內自帶)，試驗在10 d完成，有雙份陰陽性對照，共計20份陰陽性對照結果。將已知濃度的5種HBV血清學標志物低值質控血清進行系列稀釋，每項稀釋結果在ADDCAER1100上檢測20次，找到陰陽性結果各占50%的標本，可確定該標本濃度為臨界值(cut off值)濃度。配置5種HBV血清學標志物濃度為臨界值±20%的分析物，分別在ADDCAER1100上測定20次，記錄結果。臨界值95%置信區間(CI)的結果判定以樣本/臨床值比值(S/CO值)表示：HBsAg、HBsAb、HBeAg的S/CO≥1為陽性，S/CO<1為陰性；HBeAb、HBcAb的S/CO<1為陽性，S/CO≥1為陰性。+20%濃度臨界值的分析物檢測陽性率不小于95%，同時-20%濃度臨界值的分析物檢測陰性率不小于95%，說明臨界值±20%的濃度位于該檢測方法的95%CI內[2]。

2 結 果

2.1 方法學比較 兩套檢測系統的一致性結果顯示：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb的總符合率分別為99.0%、99.5%、99.5%、98.0%、100.0%，陽性符合率分別為98.0%、100.0%、99.0%、97.0%、100.0%，陰性符合率分別為100.0%、99.0%、100.0%、99.0%、100.0%，Kappa系數分別為0.98、0.99、0.99、0.96、1.00。見表1～5。

表1 HBsAg檢測 的方法學對比

表2 HBsAb檢測的方法學對比

表3 HBeAg檢測的方法學對比

表4 HBeAb檢測的方法學對比

表5 HBcAb檢測的方法學對比

2.2 重復性試驗 ADDCAER1100檢測設備重復性試驗顯示：HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb低值質控品分別稀釋4、3、3.4、1.6、1.7倍的濃度為其臨界值濃度，±20%濃度臨界值標本陽(陰)性率均不小于95%，95%CI分別為：96.6%～99.5%、97.6%～99.5%、97.6%～99.5%、94.7%～99.5%、98.6%～99.5%。CV批內均在10%左右，CV批間均小于15%。見表6。

表6 ADDCAER1100檢測儀HBV血清學標志物 重復性試驗結果

注：-20%為臨界值-20% 分析物濃度；+20%為臨界值+20% 分析物濃度。

3 討 論

本研究以HBV血清學標志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb為例，進行方法學對比和重復性試驗，用于ELISA的方法學評價，結果顯示：在方法學對比中，以化學發光法為原理的Architect I2000和ELISA為原理的ADDCAER1100同時檢測HBV血清學標志物的結果一致性較強；在重復性試驗中HBV血清學標志物標本濃度在±20%臨界值標本位于95%CI內，對于臨界濃度不小于20%的標本也能得到穩定的結果。

在臨床試驗室使用新的試劑、系統或更換試劑、系統時，為了保證標本檢測結果的準確性和可靠性，在開展檢測項目前需要進行性能評價。在性能評價的方法學對比中，定性試驗通常運用2種或2種以上的檢測方法(儀器)。由于最終的診斷結果未知，或無診斷的金標準，定性方法又分為已知診斷的定性試驗和未知診斷的定性試驗，未知診斷的定性試驗往往對比幾種檢測方法的一致性，采用幾種檢測方法的陰性和陽性符合率表示[2-4]。本試驗以HBV血清學標志物檢測為例，以化學發光法為原理的Architect I2000作為參考儀器，以新引入科室的以ELISA為原理的ADDCARE1100為試驗儀器。兩種方法學對比時，需注意標本的選擇應具有代表性，陽性標本應該隨機選擇，用Kappa檢驗判斷兩套檢測系統一致性的強弱[3-5]。

定性試驗的重復性研究是檢驗測量臨界值精密度的方法。檢測高值的陽性標本或陰性低值是不合適的，因為它們的結果明顯超出了醫學決定值。而在臨界值附近同一份標本常出現不一樣的結果[6]，本試驗根據EP12-A文件的重復性試驗方法，評估濃度在臨界值附近的標本的精密度，通過重復測量±20%臨界值的標本是否在該檢測方法的臨界值95%CI(重復測定臨界值附近的標本，得到95%陽性并且95%陰性的結果的濃度范圍，稱為該檢測方法的臨界值的95%CI)來評價該試驗方法的精密度[2]。

本研究在方法學對比中顯示兩套系統同時檢測HBV的5項血清學標志物的結果一致性較強。在重復性試驗中，±20%臨界值的標本均在95%CI內，對于臨界濃度不小于20%的標本能夠得到穩定的結果。臨界值的CV批內值均在10%左右，CV批間<15%，說明ADDCAER1100全自動酶免工作站的穩定性和準確性符合臨床標本檢測要求，可運用于臨床HBV的檢測。

[1]中華醫學會肝病分會，中華醫學會感染學分會．慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J]．中華肝臟病雜志，2011，19(1)：13-24．

[2]NCCLS．User protocol for evaluation of qualitative test performance proposed guideline[S]．Wayne，PA，USA：NCCLS，2002．

[3]夏邦世，吳金華．Kappa一致性檢驗在檢驗醫學研究中的應用[J]．中華檢驗醫學雜志，2006，29(1)：83-84．

[4]中國合格評定國家認可委員會．CNAS CL39:醫學實驗室質量和能力認可準則在臨床免疫學檢驗領域的應用說明[S]．北京：中國合格評定國家認可委員會．2012．

[5]黃嫵嬌，黃憲章，莊俊華，等．CLSI EP12-A2文件在HBeAb定性檢測性能評價中的應用[J]．檢驗醫學，2012，27(11)：900-903．

[6]陳桂三，張秀明，熊繼紅，等．未知診斷定性試驗分析性能評價方法探討[J]．檢驗醫學，2010，25(12)：978-981．

Performance evaluation of ELISA for detecting HBV serological markers*

LUTing,LIFa-ke,LUOJie,YANGShao-jun,PANFeng,ZHANGMing-xu,CHENMing△

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapingHospital,ResearchInstituteofFieldSurgery,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To conduct the performance evaluation of the qualitative tests in the ADDCAER ELISA 1100 automated workstation by detecting the hepatitis B virus (HBV) serological markers.Methods According to EP12-A document promulgated by the National Committee for Clinical Laboratory(NCCLS),with the Architect I2000 automatic chemiluminescence immunoassay analyzer as the reference method,the methodological comparison and the repeatability test of the HBV serological markers detection by the ADDCARE ELISA automated workstation were performed for completing its qualitative test performance evaluation.Results The methodological comparison showed that of the total coincidence rate of HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HBcAb were 99.0%,99.5%,99.5%,98.0% and 100.0%,respectively;the positive coincidence rates were 98.0%,100.0%,99.0%,97.0% and 100.0%,respectively;the negative coincidence rate were 100.0%,99.0%,100.0%,99.0% and 100.0%,respectively;the Kappa values were 0.98,0.99,0.99,0.96 and 1.00 respectively.The repeatability tests showed that the positive(negative) rates of critical value in HBsAg,HBsAb,HBeAg,HBeAb and HBcAb within ±20% concentration ≥ 95%,the 95% confidence intervals were 96.6%-99.5%,97.6%-99.5%,97.6%-99.5%,94.7%-99.5% and 98.6%-99.5%,respectively.Conclusion The results of the ADDCAER ELISA 1100 automated workstation and the Architect I2000 automatic chemiluminescence immunoassay analyzer for detecting the HBV serological markers have strong consistency.The ADDCAER ELISA 1100 automated workstation for detect HBV serological markers obtains the stable results within ± 20% concentration near cutoff points and is reliable in performance,thus can be used to qualitatively detect HBV serological markers in clinical specimens.

enzyme-linked immunoadsordent assay； qualitative test； performance evaluation； hepatitis B virus； serological markers

衛生部專項課題資助項目(28-1-5)。

盧婷，女，在讀碩士，初級檢驗師，主要從事乙型肝炎傳染研究。△

，E-mail：chming1971@126.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.05.003

A

1672-9455(2015)05-0582-03

2014-10-20

2014-12-10)