3種細胞因子在膀胱尿路上皮癌的表達及其臨床意義*

張宗顯，王沈陽，劉 翠，郭永順，高同斌，王穎慧

(1.濰坊醫學院外科學教研室，山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫院 261000；3.山東省泗水縣柘溝中心衛生院 273200)

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·論 著·

3種細胞因子在膀胱尿路上皮癌的表達及其臨床意義*

張宗顯1，王沈陽2△，劉 翠3，郭永順2，高同斌2，王穎慧2

(1.濰坊醫學院外科學教研室，山東濰坊261053；2.山東省濰坊市人民醫院 261000；3.山東省泗水縣柘溝中心衛生院 273200)

目的 探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、CD74、血管內皮生長因子(VEGF)在膀胱尿路上皮癌組織中的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組織化學方法對80例膀胱尿路上皮癌患者癌組織和15例膀胱正常組織中MIF、CD74和VEGF的蛋白表達水平進行檢測，并分析其與臨床病理特征和預后的關系。結果 MIF、CD74和VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中高表達，在正常膀胱黏膜組織中無或弱表達，差異有統計學意義(P<0.05)。腫瘤細胞胞質內MIF、CD74和VEGF的表達與組織學分類、病理分級、臨床分期均呈正相關(P<0.05 )。而且相關性分析發現，MIF與CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達呈正相關(r=0.839，P<0.05)，且MIF與VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中的表達亦呈正相關(r=0.753，P<0.05)。結論 MIF可能通過與CD74相互作用，上調VEGF表達促進腫瘤微血管生成，促進膀胱尿路上皮癌的發生發展,使其有望成為膀胱尿路上皮癌治療的有效靶分子。

膀胱腫瘤； 尿路上皮癌； 巨噬細胞移動抑制因子； CD74； 血管內皮生長因子

膀胱尿路上皮癌是最常見的泌尿系統腫瘤且易復發及轉移。雖然有關該病的診斷治療近年取得了較大進展，但其具體發生機制目前并未完全明確。前期研究表明，導致腫瘤發生發展的病理基礎是細胞因子的異常表達[1]，因此進一步研究膀胱尿路上皮癌發生發展過程中的相關基因，對確定特異性腫瘤標志物、早期診斷、了解預后因素、確定生物治療靶標有重要意義。為了探討巨噬細胞移動抑制因子(MIF)、CD74、血管內皮生長因子(VEGF)與膀胱尿路上皮癌的關系及臨床意義，本研究采用免疫組織化學方法檢測MIF、CD74 和VEGF蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中的表達，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 80份標本均取自濰坊市人民醫院泌尿外科2012年10月至2014年4月行手術切除并經病理證實的膀胱尿路上皮癌組織。80份膀胱尿路上皮癌組織按世界衛生組織病理(1998)分級標準進行組織學分級：Ⅰ級23例，Ⅱ級27例，Ⅲ級30例。其中男56例，女24例，所有患者術前均未接受化療、放療或免疫治療，所取標本患者年齡29～89歲，平均64歲。15份作對比的膀胱正常組織為前列腺TURP手術中所取。

1.2 材料 MIF(FL-115)兔抗人多克隆抗體、鼠抗人CD74單克隆抗體及DAB顯色液購自Santa Cruz生物技術有限公司。VEGF(NAB-O243)鼠抗人單克隆抗體、S-P試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 10%甲醛固定組織，常規石蠟包埋組織，連續切片4 μm厚，每例各備4張，分別作HE染色和免疫組化染色，采用SP免疫組織化學三步法，具體操作按說明書進行，試劑盒內已知陽性片作為陽性對照。

1.4 結果判斷標準 免疫組織化學染色定量和定性分析應用尼康高級研究型顯微鏡(Nikon80i，Japan)盲法進行。在高倍鏡下(×400)計數1 000個細胞，分別由兩位經驗豐富的病理科醫師采用雙盲法根據切片中細胞質或細胞膜中出現棕黃色顆粒為陽性判定標準，染色結果以陽性細胞數所占百分比和陽性細胞著色強度作為判斷依據，獨立觀察后一起作出判斷。標本無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例計分：陽性細胞數少于 25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將染色強度評分和陽性細胞百分比例評分兩項指標相乘大于或等于4分為陽性表達，小于4分為陰性表達。

1.5 統計學處理 所有資料采用SPSS17.0統計軟件進行統計學處理。計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行組間比較分析。相關性分析采用Spearman等級相關性分析。以α=0.05為檢驗水準，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MIF、CD74、VEGF的蛋白表達與組織學分類、病理分級、臨床分期的關系 在膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF三者的陽性表達明顯高于膀胱正常組織，差異有統計學意義(P<0.05 )。并且在膀胱尿路上皮癌組織中三者的蛋白表達與病理分級、組織學分類、臨床分期有關，表明MIF、CD74、VEGF在膀胱尿路上皮癌中的表達隨著腫瘤的惡性程度增高而增強(圖1及圖2)，在浸潤型腫瘤中表達明顯高于非浸潤型，差異均有統計學意義 (P<0.05)。見表1。

圖1 高分化膀胱尿路上皮癌組織中MIF

臨床特征nMIFCD74VEGF組織學分類正常患者151(6.67)2(13.33)2(13.33)腫瘤患者8064(80.00)66(82.50)68(85.00)病理分級高分化5036(72.00)37(74.00)38(76.00)

續表1 膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF 蛋白表達與臨床特征的關系[n(%)]

注：低分化(Ⅲ期)，高分化(Ⅰ期+Ⅱ期)；浸潤型(Ⅱ期+Ⅲ期+Ⅳ期)，非浸潤型(Tis期+Ⅰ期 )。

圖2 低分化膀胱尿路上皮癌組織中

2.2 MIF、CD74、VEGF蛋白在膀胱尿路上皮癌中表達的相關性 經Spearman非參數相關檢驗，結果MIF與CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達呈正相關(r=0.839，P<0.05)；MIF與VEGF的表達呈正相關(r=0.753，P<0.05)。見表2、3。

表2 80例膀胱尿路上皮癌組織切片免疫組化中 MIF和CD74表達相關性

注：+表示陽性，-表示陰性。

表3 80例膀胱尿路上皮癌組織切片免疫組化中 MIF和VEGF表達相關性

注：+表示陽性，-表示陰性。

3 討 論

MIF 是1966年Bloom等[2]首次發現由活化T淋巴細胞分泌的可抑制單核巨噬細胞移動的細胞因子。MIF在惡性腫瘤中的作用越來越受到人們重視。研究報道MIF在肝癌、 肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌及食管癌等腫瘤細胞中過度表達，提示MIF參與了多種腫瘤的發生發展過程[3-7]。CD74存在于某些上皮細胞表面，是MIF的高親和力受體，有研究發現MIF與CD74在癌組織中共表達，兩者結合可促進細胞的增殖并可調節促血管新生的趨化因子分泌，而VEGF是目前活性和專屬性最強的血管生成因子,在正常組織和腫瘤組織中都發揮著強大的促血管生成作用。血管生成是惡性腫瘤發生發展及轉移的關鍵之一,并且VEGF幾乎都參與惡性腫瘤的發生發展過程[8]。在膀胱尿路上皮癌中MIF可能通過作用于其細胞表面受體CD74，使其分泌VEGF，為腫瘤的生長、侵襲、轉移奠定營養基礎。

本研究結果顯示，在膀胱尿路上皮癌組織中MIF、CD74、VEGF蛋白均呈現高表達，與膀胱正常組織相比，差異均有統計學意義(P<0.05)，表明MIF、CD74、VEGF可能在膀胱尿路上皮癌的發生發展過程中發揮重要作用。MIF在膀胱尿路上皮癌低分化腫瘤中表達明顯高于高分化腫瘤，其表達量與膀胱尿路上皮癌惡性度呈正相關，說明其促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。雖然MIF促進膀胱尿路上皮癌發生和轉移的作用機制仍不完全清楚，但推測可能與其受體CD74結合形成復合物有關[9]。作為組織相容性抗原重要分子伴侶CD74，不僅在抗原遞呈細胞表達[10]，還在上皮細胞如膀胱上皮細胞中高表達，并與腫瘤的發生有關。一般認為CD74 作為MIF 的受體，二者的結合能夠激活促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路，刺激細胞增殖。本研究結果也提示MIF和CD74在膀胱尿路上皮癌組織中的表達呈正相關，提示與CD74分子結合可能是MIF在膀胱尿路上皮癌中發揮作用所必需的一個步驟，從而使腫瘤細胞無限制地增長、增殖。

腫瘤細胞可自分泌或旁分泌VEGF，促進血管的構建，為腫瘤的生長、浸潤和轉移奠定基礎，從而促使癌細胞迅速增長[11-12]。VEGF具有較強的血管滲透作用，可引起血漿蛋白及纖維蛋白外滲，隨著血管內皮細胞的遷移和增殖，最終形成新的基質和血管。本研究結果表明MIF和 VEGF在膀胱尿路上皮癌組織中的表達明顯高于正常膀胱組織，且呈正相關關系，提示MIF可能通過上調VEGF表達，刺激腫瘤新生血管形成，為腫瘤細胞生長提供了豐富的血液，從而促進膀胱尿路上皮癌的浸潤和轉移。

本研究表明MIF、CD74、VEGF三者在膀胱尿路上皮癌組織中表達增高，且呈正相關協同一致性，MIF可能通過上調CD74及VEGF的表達促進膀胱尿路上皮癌的進展，但其確切機制有待進一步研究。深入探究這些基因可為膀胱尿路上皮癌的診斷、治療方案的選擇及預后判斷提供重要的實驗依據。

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The expression and clinical significance of cytokines in urothelial cell carcinoma of bladder*

ZHANGZong-xian1，WANGShen-yang2△，LIUCui3，GUOYong-shun2,GAOTong-bin2,WANGYing-hui2

(1.Teaching-researchOfficeofSurgery,WeifangMedicalUniversity，Weifang,Shandong261053，China；2.People′sHospitalofWeifang,Weifang,Shandong261000，China；3.ZhegouTownHospitalofSishuiCounty,Weifang,Shandong273200，China)

Objective To investigate the expressions and clinical significance of macrophage migration inhibitory factor (MIF),CD74 and vascular endothelial growth factor (VEGF) in the urothelial cell carcinoma of bladder.Methods The expressions of MIF,CD74 and VEGF in 80 samples of urothelial cell carcinoma bladder tissues and 15 samples of normal bladder tissues were detected by immunohistochemistry method,and the relationships between these indicators with clinicopathological features and prognosis were analyzed.Results The expressions of MIF,CD74 and VEGF in the bladder urothelial cell carcinoma tissues elevated significantly compared with those of the normal bladder tissues,the differences were significant (P<0.05).The expressions of MIF,CD74 and VEGF in the tumor cell plasma were positively related with the histological classification,pathological grade and clinical stages (P<0.05).The correlation analysis showed that the expression of MIF was positively related with CD74 and VEGF in the bladder urothelial cell carcinoma tissues (r=0.839;r=0.753,P<0.05).Conclusion MIF might interact with CD74 to upregulate the expression of VEGF,promote the angiogenesis and involved in the tumor development and progression,MIF might be an effective molecular target in the treatment of urothelial cell carcinoma of the urinary bladder.

urothelial cell carcinoma； bladder neoplasms； macrophage migration inhibitory factor； CD74； vascular endothelial growth factor

山東省濰坊市科學技術發展計劃資助項目(第20121159號)。

張宗顯，男，在讀研究生，主要從事泌尿外科的臨床研究。△

,E-mail：1035187938@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.04.010

A

1672-9455(2015)04-0457-03

2014-07-29

2014-10-28)