α-蒎烯對黃粉蟲體內(nèi)3種保護酶活性的影響

王 慧，馬 玲，孟慶坤，崔榮林

(1．東北林業(yè)大學林學院，林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040;

2．黑龍江省七臺河市林業(yè)局，黑龍江七臺河154600)

α-蒎烯是多種植物精油活性成分的重要組成部分，具有很強的抑菌性、殺蟲活性，是植物揮發(fā)性有機化合物［1－3］。α-蒎烯以及含有α-蒎烯的植物精油對儲藏物害蟲、大田害蟲、森林害蟲和某些病菌均具有較強的生物活性。在綜合防治有害生物的領(lǐng)域中，α-萜品醇有著重要的研究價值和廣闊的綜合利用空間，其對有害生物的作用機理可為有害生物綜合治理提供新的方法和理論依據(jù)。

外源物對生態(tài)系統(tǒng)的影響最初是從個體分子開始，然后在細胞、器官、個體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)等各個層面上逐步表現(xiàn)出來，是現(xiàn)代毒理學的觀點［4］。目前，利用農(nóng)藥對昆蟲體內(nèi)SOD、POD、CAT等產(chǎn)生的影響，已在農(nóng)藥評價中得到廣泛的應(yīng)用和良好的驗證。因此，研究α-蒎烯對黃粉蟲體內(nèi)生物化學標志物(SOD、POD、CAT)的影響，明確該種外源物濃度與主要酶活性的關(guān)系，對于研究其對昆蟲的致毒機理具有重要意義。為此，筆者采用熏蒸法測定了α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲的急性毒性，并測定了對其體內(nèi)SOD、POD、CAT 3種酶活性的影響，旨在為研究α-蒎烯的殺蟲活性與作用機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 供試藥劑。α-蒎烯購自美國Sigma公司。

1．1．2 供試昆蟲。黃粉蟲(Tenebrio molitor)和麥麩均購自黑龍江哈爾濱市大發(fā)花鳥魚市場，將黃粉蟲置于(23±2)℃、相對濕度70%的生化培養(yǎng)箱中以麥麩喂養(yǎng)，馴化15 d后挑選大小一致、健康的黃粉蟲幼蟲供試驗用。

1．1．3 試劑。購自Amresco公司的包括苯甲基磺酰氟(PMSF)、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、乙二胺四乙酸、二硫蘇糖醇、核黃素、還原型谷胱甘肽、對硝基苯酚和對硝基苯酚磷酸二鈉等;購自Sigma公司的包括毒扁豆堿、固藍B鹽，1-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)等;購自天津市光復(fù)精細化工研究所的有愈創(chuàng)木酚;購自國藥集團化學試劑有限公司的有過氧化氫、α-乙酸萘酯、硝基氮藍四唑、L-甲硫氨酸、苯酚等。1．1．4 儀器。玻璃勻漿器(黑龍江省譽航科學器材有限公司)、HPG-400BX 400HX光照培養(yǎng)箱(黑龍江哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海森信實驗儀器有限公司)、TH-500BQ超聲波清洗儀(山東濟寧天華超聲波電子儀器有限公司)、Cary 100/300雙光束紫外可見分光光度計(美國瓦里安中國有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 急性毒力測定。采用廣口瓶密閉熏蒸法［5］。

1．2．2 致毒處理設(shè)置。以 α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲48 h的LC50為基準［6］，用蒸餾水配制 LC20，設(shè)置不施藥的 12、24、36、48 h黃粉蟲幼蟲為空白對照，選取健康、大小、顏色一致的黃粉蟲幼蟲，每組100頭，每濃度處理3次重復(fù)。處理后12、24、36、48 h分別從每個濃度處理中隨機挑選10頭幼蟲作為樣本，存放于－80℃冰箱中，供酶活性測定。

1．2．3 酶液制備。隨機選取經(jīng)過藥劑處理的黃粉蟲幼蟲10頭，加預(yù)冷的提取液5 ml，并置于玻璃勻漿器內(nèi)冰浴，再充分勻漿，然后采用4℃高速離心，上清液即酶液。SOD、POD、CAT所用勻漿液和離心參數(shù)如下:勻漿液為0．05 mol/L PBS，離心力為 15079 ×g，離心 30 min［7］。

1．2．4 蛋白質(zhì)含量測定。參照Bradford(1976)的考馬斯亮藍 G-250 法［8］。

1．2．5 昆蟲體內(nèi)酶活性測定。

1．2．5．1 SOD 活性測定。參照 Beauchamp 等的方法［9］，略有改進。3．0 ml反應(yīng)液［含 50．0 mmol/L PBS(pH7．8)，13．0 mmol/L Met，0．1 mmol/L EDTA，75 μmol/L NBT］，加入25 μl粗酶液，最后加入0．6 ml 0．5 mmol/L核黃素，以不加酶液管作為最大光還原管，在25℃光照培養(yǎng)箱中三級光照下(4 000 lx)處理15 min后立即避光測定OD560值。

1．2．5．2 POD 活性測定。參照 Simon 等的方法［10］，略有改進。3．0 ml反應(yīng)體系中含100．0 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.0)、30．0 mmol/L 愈創(chuàng)木酚、26．0 mmol/L 過氧化氫和150.0 mmol/L酶液，反應(yīng)5 min，在470 mm波長處測定OD值。

1．2．5．3 CAT 活性測定。參照Cohen 方法［11］。取0．5 ～0．6 ml 30% 過氧化氫，加水至 50 ml，從中取出 4．0 ml，加入 26．0 ml 0．05 mol/L PBS(pH 7．0)，測定240 nm 波長處的 OD 值，如其OD值在0．50～0．55，即作為CAT的底物溶液，再取3．0 ml配制的底物溶液，并在25℃下加入20μl粗酶液，然后立即用紫外分光光度計在240 nm波長下每隔30 s讀一次，記錄3 min。

1．2．6 數(shù)據(jù)處理。用Excel繪圖。運用SPSS16．0軟件中的Duncan’s方法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲的毒力 由表1可知，α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲 12、24、36 和 48 h 的 LC50分別為 101．434、67.518、57．810 和44．120 μg/L，隨作用時間的延長 LC50逐漸降低，表明α-蒎烯對黃粉蟲的毒性作用隨時間的增加而逐漸加強。選擇α-蒎烯48 h的LC50和LC20作為處理濃度，測定α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲7種酶的影響。為反應(yīng)遲鈍，用探針輕觸后不能正常反應(yīng)，從癥狀來看應(yīng)該是麻醉后又蘇醒的幼蟲。

表1 α-蒎烯對黃粉蟲幼蟲的毒力

2．3 α-蒎烯對黃粉蟲體內(nèi)SOD活性的影響 由圖1可知，黃粉蟲幼蟲經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，體內(nèi)SOD酶活性均顯著低于對照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，最大抑制率分別為對照的50．96%和49．48%。

2．2 中毒癥狀 在熏殺試驗中觀察到，在接入廣口瓶初期幼蟲均表現(xiàn)出不同程度的興奮癥狀，如翻滾、跳躍、快速爬行等;隨著作用時間的延長，幼蟲行動都漸趨緩慢，直至靜止不動(也有被麻醉的可能性)。經(jīng)過12、24、36、48 h后分別觀察記錄，處理組的部分幼蟲出現(xiàn)蟲體變黑，抽搐、痙攣的現(xiàn)象，并且偶有吐水的現(xiàn)象，蟲體失水變軟、萎縮，最后直至死亡;處理組的少部分幼蟲被麻醉但沒有完全死亡，活動緩慢且行

2．4 α-蒎烯對黃粉蟲體內(nèi)POD活性的影響 由圖2可知，黃粉蟲幼蟲經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，除LC20、LC50濃度的α-蒎烯12 h酶活性高于對照外，體內(nèi)POD酶活性均低于對照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，最大抑制率分別為對照的40．74%和14．75%。隨著處理時間的延長，用LC20濃度的α-蒎烯處理后的幼蟲體內(nèi)POD酶活性表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，而LC50濃度的α-蒎烯處理后幼蟲體內(nèi)POD酶活性表現(xiàn)為下降趨勢。

2．5 α-蒎烯對黃粉蟲體內(nèi)CAT活性的影響 由圖3可知，黃粉蟲幼蟲經(jīng) LC20、LC50濃度的 α-蒎烯處理 12、24、36、48 h后，體內(nèi)CAT酶活性均顯著低于對照。LC20、LC50濃度的α-蒎烯最大抑制率分別出現(xiàn)在36和48 h，其最大抑制率分別為對照的34．62%和35．64%。

3 結(jié)論與討論

試驗表明，α-蒎烯的LC20、LC50濃度對黃粉蟲體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)12、24、36、48 h的影響雖然存在差異性，但均表現(xiàn)出具有抑制功能。綜合時間－劑量效應(yīng)及酶受到抑制的程度，3種酶對α-蒎烯脅迫的敏感性從大到小依次為SOD、POD、CAT。關(guān)系尚需進一步研究。

α-蒎烯能夠影響黃粉蟲幼蟲體內(nèi)SOD、POD和CAT的活性，并且隨著處理時間的延長和濃度的增加呈現(xiàn)出一定的時間－濃度效應(yīng)，幼蟲體內(nèi)的SOD、POD和CAT均表現(xiàn)為抑制作用，導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)平衡受到破壞，自身生理機能下降，最終導(dǎo)致幼蟲的死亡。該3種保護酶均參與了黃粉蟲幼蟲對α-蒎烯的應(yīng)答機制，而關(guān)于α-蒎烯與該3種酶系基因水平的

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