制備全人源抗體的新方法研究進展

蔣一葦，譚樹華

(中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇南京211198)

抗體(Antibody)，亦稱免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)，是一種由B淋巴細胞產生的糖蛋白分子，可以特異性地結合抗原。抗體的基本結構包括2個相同的重鏈和2個相同的輕鏈。N-端為重鏈可變區(Variable region of heavy chain，VH)和輕鏈可變區(Variable region of light chain，VL)，負責結合抗原;C-端為恒定區，重鏈的恒定區可以與免疫系統的其他分子相互作用以發揮相應的效應［1］。

抗體作為疾病預防、診斷和治療的制劑，已有超過100年的發展歷史。隨著抗體技術的發展，制備抗體的方法已由多克隆抗體技術和單克隆抗體技術，發展為基因工程抗體技術。其中，基因工程抗體以其對人體毒副作用小、人源化和高度特異性，越來越顯示其優勢［2］。近些年，在基因工程抗體的研究中越來越多的研究者通過從人B細胞中直接獲取抗體的方法，獲得了全人源的單克隆抗體。由于這些抗體是在人體內自然產生的，它們的安全性、有效性和與人類疾病的相關性都比傳統的鼠源抗體有了明顯的提升。這些全人源抗體作為一種靶向治療有很好的應用前景。例如，過去人們認為，只有極少的抗體能對抗一系列不停進化的病毒，如流感病毒和人免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)，并且這種抗體極難分離。然而，以優化的篩選過程和精挑細選的感染者作為抗體來源，研究者采用高通量技術已成功分離和鑒定了幾種這樣的抗體。此成果在抗體介導的治療和疫苗設計中有很好的應用［3］。

總體來看，通常直接從B細胞中獲得這種全人源的單克隆抗體的方法有3種:①從人源的噬菌體抗體庫中篩選;②使B細胞永生化，然后進行體外篩選;③細胞分選后，進行克隆和表達免疫球蛋白基因［3］。筆者對制備全人源抗體的新方法進行了綜述。

1 噬菌體抗體庫

1．1 噬菌體抗體庫的基本原理和發展歷程 噬菌體展示技術(Phage display)是構建抗體庫的常用方法。該技術的基本原理是:將抗體片段的基因克隆到噬菌體基因中，與噬菌體外殼蛋白融合表達在噬菌體表面。噬菌體把抗體的基因型和表現型融為一體，每個噬菌體顆粒“展示”一種抗體，這些重組噬菌體的集合稱為一個噬菌體抗體庫。這種“展示”抗體的噬菌體既能識別相應抗原并與其結合，又能感染宿主菌以進行再擴增，利用抗原抗體特異性結合進行篩選、富集和擴增，從而得到所需的抗體片段［4-7］。

噬菌體展示是一門發展迅速的技術。20世紀80年代中期，George Smith就在M13噬菌體表面表達了一段外源蛋白的片段［8］，開創了噬菌體展示的先河。1991年劍橋大學James D Marks［4］等系統講述了構建單鏈抗體庫的過程，從人血中分離出外周血淋巴細胞，提取出總RNA，以RNA為模版逆轉錄為cDNA。通過對抗體的保守序列進行分析，分別設計出了擴增重鏈(VH)、輕鏈(VL)的引物。以逆轉錄得到的cDNA為模版，通過PCR技術擴增到抗體重鏈、輕鏈的基因，再通過重疊延伸PCR(Overlap PCR)使重鏈和輕鏈以1個45 bp大小的連接物(Linker)隨機相連，形成只有抗體可變區序列的單鏈抗體。克隆單鏈抗體基因，以融合蛋白的形式表達于噬菌體表面，得到庫容大于107的單鏈抗體庫。

此后，很多研究者在此研究的基礎上，對單鏈抗體庫的構建進行了改進。由于在一般情況下篩選出抗體的親和力與庫容的大小成正比，研究者開始嘗試構建庫容更大的抗體庫［9-11］。1996 年 Tristan J Vaughan［9］等分別構建了 VH 和VL庫，然后組裝成scFv庫，庫容高達1．4×1010。1998年Michael D Sheets等［10］也分別構建了VH和VL庫，但是對組裝成scFv的步驟進行了優化，研究者選擇在VH基因的5’端和VL基因的3’端延伸了大概200個堿基對(Base pair，bp)的位置設計引物，由此得到延長的VH和VL，從而組裝成的scFv兩端也會有延長的序列，延長的序列不僅保證了酶切位點兩端保護堿基足夠的長度，提高了酶切效率，還有利于鑒定scFv是否正確組裝。最終研究者得到庫容為6．7×109的單鏈抗體庫，并篩選出更高親和力的抗體。2000年Daniele Sblattero等［11］采用了Cre催化重組的方法，進一步提高了庫容。首先，研究者構建了一個相對小的初級抗體庫(庫容為7×107)，其中VH和VL基因被2個非同源的lox位點分開;然后，通過噬菌粒感染能表達Cre的宿主菌，使VH和VL基因重組。采用該方法構建的抗體庫，庫容高達3×1011。

1．2 噬菌體抗體庫的特點 噬菌體展示技術的最大特點是能夠將表達的目的蛋白與其基因序列相對應，并且其本身具有的可選擇性和可擴增性，已成為一種非常高效的表達、篩選和擴增抗體的體系。該技術繞過了免疫動物的方式制備抗體，能夠避免鼠源性抗體誘發的不良免疫反應［4］。此外，這種體外篩選的方法可以克服免疫耐受，能篩選出高親和力的抗體來結合高度保守的靶點，如泛素和組蛋白等［12］。

然而，噬菌體抗體庫的限制也很明顯，由于建庫所使用的是原核表達系統，該系統糖基化過程的缺失和一定程度上的大分子空間結構的錯誤折疊，可能會導致抗體失去應有的功能［13］。因此，在篩選結構功能復雜的抗體時篩選后的后期修飾和表達優化是非常必要。

1．3 噬菌體抗體庫的應用現狀 自從20多年前抗體庫技術的出現，已經有許多抗體通過體外抗體庫篩選的方法被發現并得到應用(表1)，其中有些抗體有很突出的性質和功能，甚至從未用免疫動物的方法得到［12］。隨著分子克隆和高通量篩選等技術的進一步發展，抗體庫技術會在未來將具有更加廣闊的發展空間。

表1 一些從抗體庫中篩選得到的抗體

2 B細胞永生化

采用雜交瘤技術，鼠源B細胞可以永生化，但是人B細胞難以通過這種方式永生化［3］。然而，另一種方法的出現使人B細胞永生化變為現實。1977年，研究者采用Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus，EBV)介導的轉化使人記憶B細胞永生化［22］，但是該方法的低效率令研究者難以獲得大量的抗原特異性B細胞。直到2004年，研究者在EBV感染前和感染過程中，通過用Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)的激動劑CpG DNA或其他多克隆激動劑來激活B細胞，使轉化效率有了大幅提升［23］。這種提高EBV轉化率的試驗方案目前已被廣泛用于制備單克隆抗體。

典型的人B細胞永生化過程包括分離和培養外周血淋巴細胞或分選出來的IgG+記憶B細胞，感染EBV，并加入TLR9的配體和/或經照射的異基因單核細胞來提供共刺激信號。在此條件下，B細胞增殖并分泌抗體。7～14 d以后，在培養細胞的上清中檢測抗原結合和/或病毒中和。產生目的抗體的B細胞經過克隆后進行進一步篩選，得到在單細胞水平有最優活性的B細胞，然后進行免疫球蛋白基因的克隆和測序［23］。

由于記憶B細胞的永生化和高通量篩選抗原特異性B細胞技術的出現，使得研究者可以篩選稀有的B細胞，即使接觸抗原在很久以前發生，也可以篩選得到其抗體。例如，研究者從年長者的血液中分離并永生化了幾十年前形成的記憶B細胞，從而篩選出了針對早已不流行的流感病毒抗體［24］。采用B細胞永生化方法制備單克隆抗體的問題主要在于:該方法需要篩選大量的B細胞才能獲得所需的特異性抗體，一般情況下，培養和篩選超過10 000的記憶B細胞才能獲得不到10個特異性的B細胞［3］。

3 單細胞克隆表達

單細胞逆轉錄PCR的應用極大地促進了人源單克隆抗體的發展，采用該技術可以從流式細胞儀分選得到的一種B細胞中分離同源免疫球蛋白的重鏈和輕鏈可變區基因。隨后，將這些基因克隆到真核細胞中進行表達。這種方法的優點是，無論特異性的B細胞多么稀有，只要能被流式細胞儀所識別，這種方法就能篩選到單克隆抗體［3］。

采用熒光標記的抗原來“誘捕”抗原特異性的B細胞是流式細胞儀分選的常用方法。研究者采用HIV-1表面的刺突蛋白作為探針，已經成功從患者的IgG+記憶B細胞中分離到HIV特異性的人源單克隆抗體［25］。使用流式細胞儀檢測抗原特異性的單克隆抗體主要受限于以下因素:首先，只有細胞表面表達免疫球蛋白的B細胞類型才能檢測得到;其次，需要有高度特異性并且非常穩定的抗原作為探針［3］。

4 小結與展望

噬菌體抗體庫、B細胞永生化和單細胞克隆表達是3種目前常用的從B細胞中獲得全人源單克隆抗體的方法。對于方法的選擇，除了研究者的專長外，還需要考慮制備抗體的用途和關于特定疾病B細胞免疫的已有報道，如特定的B細胞是否稀有、B細胞表面分子的表達量、結合表位的選擇等，這些細節往往是試驗成敗的關鍵。

隨著研究者使用各種方法獲得越來越多的全人源單克隆抗體，它在安全性、有效性和與人類疾病的相關性方面體現出了巨大優勢。研究者所面臨的一大挑戰是提高抗體作用的“寬度”。在某些個體中分離出來的單克隆抗體不一定在所有個體中都能起作用［3］。因此，研究者需要追蹤更廣泛的B細胞來源，進行更深層次的抗體突變和親和力成熟，才能得到作用更廣泛的治療性單克隆抗體。相信隨著抗體技術的不斷成熟和基礎研究的不斷深入，全人源單克隆抗體在生命科學和醫學中的應用將會更加廣泛。

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