神經干細胞治療臂叢神經根損傷的研究進展

張宇策(綜述),張　軍(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院骨外科，哈爾濱 150001)

分子生物醫學

神經干細胞治療臂叢神經根損傷的研究進展

張宇策△(綜述),張軍※(審校)

(哈爾濱醫科大學附屬第四醫院骨外科，哈爾濱 150001)

摘要：臂叢撕脫傷因其損傷位置特殊，單純的手術治療無法完全恢復，致殘率很高，肌功能恢復欠佳，無法達到患者預期要求。已有研究報道，神經干細胞(NSCs)在治療神經系統疾病(如膠質瘤等)方面被廣泛應用，相關的實驗中已證實其對相應的疾病恢復有明顯的促進作用，因此NSCs為臂叢神經損傷的治療提供了新的方向。雖然NSCs移植有利于臂叢神經損傷的治療，但這是一個復雜的修復過程，有十分廣闊的研究空間。

關鍵詞:神經干細胞；臂叢神經；根性損傷；臂叢撕脫傷

神經干細胞(neural stem cells,NSCs)是干細胞中的一種特殊分類，具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，能進行自我更新。自1992年NSCs被首次從小鼠紋狀體中提取并穩定傳代及分化后，NSCs逐漸被廣泛研究并應用到神經系統疾病中[1]。臂叢神經根損傷屬于外周神經系統損傷，但由于其損傷部位介于中樞和外周神經系統的交界處，決定了其治療上的特殊性。目前針對臂叢神經根損傷，雖通過手術可恢復部分功能，卻無法挽回所有損失的功能，也很難減輕損傷后神經性疼痛[2-3]。術后大部分患者更希望能通過創新性的治療(如干細胞治療、神經再植術等)來進一步恢復功能以達到日常工作的狀態[4]。因此，通過NSCs治療臂叢神經根損傷有十分重要的意義，現對NSCs應用于臂叢神經根損傷的可行性及作用等進行闡述。

1臂叢神經根的損傷機制及治療策略

臂叢神經根損傷大多發生在高速行駛的摩托車事故中。這是由于摩托車駕駛員在倒地的瞬間肩膀落地導致臂叢的牽拉力加大，瞬間的暴力將臂叢神經根拉傷。此外，常見的導致臂叢損傷的原因還包括高處墜落傷、銳器傷和醫源性損傷等。臨床所診斷的臂叢神經根損傷患者，70%是1～2個臂叢神經根的損傷[5]。

1.1臂叢神經根損傷機制外傷導致的臂叢神經根損傷是指臂叢神經根的牽拉、受損或者從脊髓直接撕脫。神經根的斷裂可以發生在脊髓背根神經節到臂叢末端的任何部位，根據損傷的部位大體可分為兩種類型：一種是撕脫損傷發生于脊髓交界區近端神經根或者根絲連續性的損傷，這種類型的損傷更接近于中樞神經系統損傷；另一種是發生于背根神經節的外周硬膜損傷,但是神經根的殘余部分仍與脊髓相連。研究表明[6]，實驗制造的臂叢撕脫傷動物模型中，高達80%的脊椎運動神經元會在損傷2周內萎縮和死亡。撕脫傷患者會伴隨麻木、臂部感覺缺失以及非常強烈而頑固的神經痛。臨床上經常會見到霍納綜合征、鎖骨上方Tinel征缺失,如伴有高位神經根損傷(橫膈膜神經，C3、C4、C5)可伴有同側偏側膈麻木，同時由于硬脊膜囊斷裂導致的節前損傷會引起假性腦水腫。

1.2有關臂叢損傷及其治療的相關研究由于椎管內的前后根僅以直徑為1.3～1.9 mm的根絲與脊髓相連，很容易在外界暴力的牽拉下將脊髓根絲從脊髓中拔出，造成臂叢的根性撕脫傷[7]。通過對成年大鼠和乳鼠的臂叢撕脫傷模型的觀察中發現，臂叢撕脫傷后可以引起內源性NSCs的增殖，但未見有神經元的分化，最終皆分化為星形膠質細胞；在神經營養因子方面，為保護臂叢神經根性撕脫傷后的神經元及促進再生,臂叢根性撕脫傷后早期成年大鼠脊髓內的神經營養因子高水平表達[8]。宋法寰等[9]在做大鼠臂叢撕脫傷術后應用Western blot方法測定相應脊髓節段C7、C8磷酸化鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在1、2、3 d及正常大鼠的表達水平，同時應用免疫熒光染色法檢測目標蛋白在1 d的大鼠脊髓節段的表達水平及空間定位，結果發現臂叢根性撕脫傷誘導磷酸化鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ在損傷節段1 d時高表達，然而在3 d時逐步下降到正常大鼠的表達水平。嚴重的神經損傷是臂叢連續性的中斷，而這種損傷需要手術才能進一步恢復功能，因為其自發性的恢復幾乎不會存在[10]。完全的臂叢撕脫傷是從C5到T1神經根的損傷，并且預后恢復最差。根據臂叢撕脫傷損傷的性質和程度不同，手術方法也不盡相同。目前臂叢撕脫傷外科治療的主流方法是神經嫁接和移植游離有功能肌肉，而且這兩種方法最有效的時間分別是創傷后 3～6個月和9～12個月。

2有關NSCs的研究

近年來，干細胞已經成為治療多種疾病的研究熱點。NSCs具有干細胞所具有的一般特點和性質，即呈未分化狀態，且不表達特異性的分化標記，具有多向分化潛能和增殖能力，可以分化為本細胞系功能不同的大部分類型細胞，而且具有多分化潛能和自我更新能力,甚至終身，同時對疾病和損傷具有反應能力，可以產生新的細胞來完成相應組織的修復。與其他干細胞相比，NSCs來源于神經系統或能產生神經組織的細胞，可產生特定種類的細胞，即可以分化為神經元、膠質細胞及其前體細胞。

2.1分離和培養方法的進展NSCs的分離主要包括流式分選法、免疫磁珠法及原代培養法，其中以原代培養法最為常用：單個NSCs可形成克隆球，經免疫組織化學鑒定其陽性表達，表明分離出的為NSCs[11]。而原代培養又可以大體分為懸浮培養法-神經球法[1]以及貼壁細胞培養法[12]和Louis等[13]創建的神經集落形成實驗。由于神經球法的方法簡單，只需嚴格按照標準的程序操作就可達到很好的重現性，因此被廣泛應用于研究胚胎、分離擴增和成體NSCs中；與懸浮培養法相比，貼壁培養法更有利于細胞的形態學觀察和獲取同質化的大數量細胞，對體內移植、基因的操作、發育學研究和進行嚴格的克隆分析具有重要意義，但也存在一定局限性，如當使用某些貼片劑時會有誘導NSCs分化的可能性，使某些實驗的研究結果受到干擾；神經集落形成細胞實驗可以用來區別NSCs和神經前體細胞，據此就能更加嚴格地評價NSCs的長期增殖和自我更新的能力，對于計數NSCs的頻率是更有意義的一種方法。

2.2NSCs遷移的研究在神經系統的發生和發育的過程中NSCs能沿著發育索的方向進行遷移。有實驗證明，移植后的NSCs同樣保留了遷移能力[14]。NSCs的遷移包括生理性遷移和病理性遷移，NSCs的定向遷移不僅對機體的生長和發育具有非常重要的作用,對于中樞神經系統的損傷修復同樣具有重大的意義[15]。調節NSCs遷移方面大體可分為遷移因子的調控和NSCs遷移的支架。遷移因子包括化學趨化因子/排斥因子(如slit蛋白、炎性趨化因子、腦源性營養因子、膠質源性營養因子及其他趨化因子)、細胞外基質、絡氨酸激酶受體、聚唾液酸神經細胞黏附分子、Doublecortin、分離信號分子[16]。NSCs遷移的支架目前已發現3種：一種是Ramaswamy等[17]發現的NSCs沿著胼胝體的纖維束遷移到對側皮質的損傷部位，并且研究發現移植到正常腦組織中的NSCs也以這種方式進行遷移；第2種遷移方式是NSCs沿著細胞的放射狀突起遷移，vimentin陽性的膠質細胞可能是NSCs遷移的導向細胞[18]；另一種遷移方式是NSCs沿著血管遷移，Shen等[19]發現NSCs在吻側遷移流的遷移流和血管平行，而NSCs依附于血管進行黏附和游走是由整合素介導的[20]，同時血管內皮細胞還會分泌一些因子對NSCs的遷移進行調節，如腦源性生長因子和血管內皮生長因子等。在NSCs沿著血管到損傷部位遷移的過程中,血管所起的作用不僅是細胞遷移的導向支架,還為NSCs的存活和分化提供一定的營養,在非神經發生區中維持NSCs的生長發育[15]。

2.3NSCs的弱免疫原性NSCs的免疫原性是影響移植免疫排斥反應的一個重要因素。細胞的免疫原性主要是由其表達的主要組織相容性抗原復合物所決定的。體外培養的NSCs免疫原性蛋白分子無表達或表達水平低，不足以引起免疫反應，同時NSCs的免疫原性受多種因素影響，如溫度、NSCs發展階段[21]等。高峰等[22]也通過實驗進一步證實了小鼠NSCs具有較弱的免疫原性，且其免疫原性明顯低于同一個體的肝細胞。因為NSCs的未分化特性，其細胞表面基本不具有免疫抗原，很少情況下被抗體識別，即有低免疫原性。因此，機體在移植異源的NSCs后，很少發生排異反應，該優點使NSCs移植在神經修復等醫學領域有較好的發展前景。

2.4NSCs移植實驗NSCs已被應用于治療多種疾病的研究中。尹昌林[23]發現將NSCs植入荷瘤鼠腫瘤局部，隨著腫瘤的生長而NSCs也不斷增長，并跟隨腫瘤細胞向其他部位遷移,如果將NSCs植入腦內遠隔腫瘤部位，它也可穿越正常腦組織進入腫瘤組織內，甚至向荷瘤鼠尾靜脈注射NSCs，在腦內也能發現注射的NSCs存在，最終達到治療腫瘤的目的。

又如在脊髓損傷模型中，移植的NSCs可以存活、遷移、分化，并且在NSCs組，腦源性神經營養因子的mRNA明顯上調，并促進生長相關蛋白43 mRNA的表達，從而改變脊髓損傷區域的微環境，NSCs在體外還能持續分泌幾種特殊的神經營養因子，起到促進軸突生長的作用。在NSCs移植治療神經退行性疾病中，曾水林等[24]在阿爾茲海默病模型中移植胚鼠端腦組織來源的NSCs后，發現其能顯著改善腦組織膠質細胞化,并降低神經元損失比例。NSCs同樣也可以應用于帕金森病的治療，在NSCs聯合膠質細胞源性的神經營養因子植入到帕金森病大鼠的紋狀體內，發現其能明顯提高帕金森病大鼠紋狀體中多巴胺的含量，對帕金森病大鼠有一定的治療效果。在治療腦創傷中，Makri等[25]通過用微量注射器反復戳傷小鼠的大腦皮質來模擬機械性腦損傷，并在原位移植入BM88/Cend1(BM88/Cend1是神經元譜系中的特異性調節因子,可以調控細胞周期退出和神經元祖細胞分化)過表達的NSCs，結果顯示，與對照組相比NSCs分化成神經元的比例提高了2.3倍，同時分化成為膠質細胞的比例降低40%，并減少了瘢痕組織的形成。

3NSCs種植于臂叢撕脫傷的實驗進展

目前，實驗證實臂叢根性撕脫傷脊髓前角NSCs移植后可為NSCs分化成星型膠質細胞和神經元提供適宜的微環境，脊髓源性NSCs移植可以明顯降低前角運動神經元的繼發性死亡，可對脊髓前角受損運動神經元起到保護作用，NSCs移植不僅能分化為神經元并且發揮神經元替代作用，還對神經根撕脫引起脊髓運動神經元死亡具有一定的保護作用,可以明顯減少神經根性撕脫后的運動神經元繼發性變性死亡[26]。有學者對比了不同的干細胞種植對臂叢撕脫傷的影響，如張軍等[10]對比了骨髓干細胞和 NSCs種植于臂叢撕脫傷的大鼠模型中，證實了 NSCs更適合治療臂叢撕脫傷。有學者主張應用胚胎干細胞，因為其具有發育的全能性，但是胚胎干細胞在移植后易形成畸胎瘤，這可能與該細胞和腫瘤細胞有著某些共同通路調節有關(如磷脂酰肌醇3-激酶通路)[27]，同時由于倫理的約束讓其應用成為主要難題。與其他成體干細胞相比，NSCs有自己特有的優點。

Trolle等[28]用含綠色熒光蛋白的脊髓NSCs種植于臂叢神經根撕脫傷的模型中發現，位于脊髓外側的移植細胞會形成表達神經膠質纖維酸性蛋白的細胞的延長的導管，這與形成感覺軸突或者脊髓表面的小細胞團有密切的聯系，其余的細胞以單個細胞形式遷移至脊髓，分化為不同神經遞質及纖維的脊髓神經元，最終得出NSCs可以在撕脫背根處很好的生存，并且在撕脫傷的外周可以明顯觀察到生長出的神經管的結論。Su等[29]對比NSCs種植于神經根撕脫傷模型和肌皮神經損傷的模型中，發現在肌皮神經損傷的模型中NSCs更容易分化成運動神經元，NSCs在適宜的環境下可以分化成具有運動功能的神經元，說明在應用NSCs治療運動神經系統疾病的同時應注意改變種植環境。Su等[30]對比臂叢撕脫傷模型后不同時間段種植NSCs發現，損傷后2周種植NSCs的生長分化及功能的恢復要優于撕脫傷后立即及6周后種植NSCs。將神經營養因子3基因導入到NSCs，對比未轉染該基因的NSCs種植于大鼠臂叢撕脫傷模型后的預后情況，得出神經營養因子3基因的局部表達確實對神經功能的恢復起到一定作用的結論。李曉濤等[31]將NSCs與雪旺細胞定期回植到頸神經根撕脫后的大鼠模型中，發現神經根回植術聯合細胞移植可以加強神經元的保護作用，在大鼠體內，移植的SCs可以存活并且持續為NSCs提供支持、保護及營養等作用，還能促進NSCs向神經元樣細胞方向分化。Su等[30]研究了鋰鹽對脊髓源性NSCs在體內和體外分化情況，發現鋰鹽可明顯促進NSCs的分化和延伸生長，并且促進NSCs表達和產生腦源性神經生長因子，然而將NSCs移植到臂叢撕脫傷模型中，經鋰鹽治療后，發現NSCs并沒有表現出促進突觸延長生長的表現，這一發現說明腦源性神經營養因子通路可能與鋰鹽誘導NSCs分化有關而并非是促進其突觸延伸，同時也證明了鋰鹽可以促進臂叢撕脫傷的NSCs向神經元的分化并且產生腦源性神經營養因子。

4結語

NSCs治療臂叢撕脫傷是一個復雜的過程，其中涉及NSCs的存活、分化、軸突生長方向、適宜的環境誘導及周圍組織提供營養等，每個環節均能影響預期的實驗效果，而其中的關系和問題目前還處于研究探索階段。但隨著技術發展以及對臂叢撕脫傷更深入的研究和認識，更多的實驗技術和方法可以為改進NSCs的治療提供幫助，如生物導管、可降解或者非可降解材料制造的神經導管、基因轉染技術使NSCs特異性表達某一特有功能后回植等的應用。由此可見，應用NSCs治療臂叢撕脫傷有廣泛的研究空間，同時NSCs的應用將為患者帶來更好的預后，大大改善其生活質量。

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Research Progress of Treatment for Brachial Plexus Injury with Neural Stem CellsZHANGYu-ce,ZHANGJun.(DepartmentofOrthopedicSurgery,theFourthAffiliatedHospitalofHarbinMedicalUniversity,Harbin150001,China)

Abstract:Brachial plexus avulsion is a special injury for its location,surgical treatment alone will not be able to realize full recovery,since the injury results in high disability rate and poor muscle function recovery,failing to meet the postoperative expectations.As it is reported that neural stem cells(NSCs) have been widely used in the treatment of nervous system diseases(such as glioma),which is a significant promoting factor for recovery of threlated disease.NSCs provide a new direction for the treatment of brachial plexus injury.NSCs transplantation is beneficial to the treatment of brachial plexus injury,but it is a complex process which means a very broad space for the research.

Key words:Neural stem cells; Brachial plexus; Root injury; Brachial plexus avulsion

收稿日期：2014-11-10修回日期：2015-02-07編輯：伊姍

基金項目：黑龍江省自然科學基金面上項目(D200901)

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.17.001

中圖分類號:Q2-33

文獻標識碼:A

文章編號：1006-2084(2015)17-3073-04