大理地區合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌MLVA法基因分型研究

聶 恒，王旭東，吳利先

大理地區合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌MLVA法基因分型研究

聶 恒，王旭東，吳利先

目的 探討MLVA基因分型法在云南大理地區合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌基因分型中的運用，初步研究其基因型特征。方法 選取大理地區61株合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌臨床分離株，采用聚合酶鏈反應(PCR)分別對VNTR位點進行檢測分析，應用BioNumerics(6.6)軟件進行聚類分析。結果 共對61株合并HIV雙重感染者的結核分枝桿菌的15個VNTR位點進行檢測，呈現出明顯的基因多態性。各個位點的分辨能力不同，其中MIRU26(0.839)最高，MIRU4(0.341)最低。經聚類分析，61株雙重感染結核分枝桿菌菌株可分為5個基因群，61個基因型，以Ⅰ型占比例最大占51.6%(32/61)；H37Rv減毒株在Ⅱ型。結論 大理地區合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌VNTR基因存在明顯多態性，主要流行菌群為北京家族基因型。

結核分枝桿菌；基因分型；雙重感染；HIV；MLVA

結核病(Tuberculosis)是一種由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染引起的可以侵害全身多個器官臟器的慢性傳染病，其中以肺結核最為常見。自1921年卡介苗(BCG)的問世和20世紀50年代以來有效的抗結核化學藥物的相繼問世與應用，結核病的肆虐與流行得到了一定的控制。但是自上世紀80年代末以來結核病的發病率呈現回升且逐年遞增的趨勢，形勢非常嚴峻。造成此種形式的一個主要原因是HIV在全世界范圍內的流行和播散。有報道約有15%～30%的AIDS患者死于結核病。另據世界衛生組織統計每年的新發結核病人中約9%是由HIV感染所造成的。研究[1]發現AIDS患者的結核病發病率是正常人群的30倍。另據世界衛生組織報道約30%的AIDS死亡病例與結核病有關。云南是我國艾滋病和結核病的高發地區。本實驗選取云南大理地區61株合并HIV雙重感染肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株。根據文獻[2-5]報道和細菌基因庫的數據，本研究篩選了15個VNTR位點，應用MLVA基因分型方法對雙感菌株進行基因分型研究。探討這些位點的分辨能力，初步了解大理地區合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌基因分型特征及流行情況，為該地區合并HIV雙重感染者結核病的防治工作提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 61株HIV感染者肺結核患者結核分枝桿菌臨床分離株由大理州疾病預防控制中心提供；結核分枝桿菌H37Rv標準減毒株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器 PCR試劑盒、100 bp DNA Mar(天根生化科技(北京)有限公司)、瓊脂、PCR儀、凝膠成像儀。

1.3 VNTR位點選擇 根據文獻報道[2-5]和細菌基因庫篩選15個串聯重復基因位點。引物由北京天根生物科技有限公司合成。

1.4 試驗方法

1.4.1 結核分枝桿菌DNA制備 將收集到的菌株接種于中性L-J培養基，37 ℃孵育培養4～6周，取生長良好的菌落溶于500 μL TE(pH8.3)中；恒溫混勻儀100 ℃，30 min；離心12 000 r/min，10 min；取上清轉移至無菌EP管中即為DNA，4 ℃備用。

1.4.2 VNTR-PCR 采用25 μL反應體系：模板DNA 3 μL，上下游引物個1 μL，ddH2O 7.5 μL，Taq Mixture12.5 μL；反應條件：預變性95 ℃、3 min；變性94 ℃、40 s，退火68.2℃、40 s，延伸72 ℃、40 s，35循環；延伸72 ℃、5 min；PCR產物置于4 ℃保存備用。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳 取5 μL擴增產物，2%瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳。在紫外凝膠成像系統下觀察結果，用100 bp Marker確定擴增產物的分子量大小，以H37Rv減毒株作為對照。

1.4.4 計算分辨指數 計算各個位點分辨指數(Hunter-Gaston，HGI)，計算公式[6-7]:

HGI=1-1/N(N-1)Σjs=1nj(nj-1)

N：總菌株數，s：獲得的基因總數，nj：j組中的菌株數

1.4.5 聚類分析 將檢測菌株呈現的PCR擴增指紋經Quantity One軟件數字化，通過H37Rv減毒株進行比對分析，進一步確定每株菌株每個VNTR位點的重復次數，并保存于Excel表中。用BioNumerics(6.6)軟件UPGMA法進行聚類分析。

2 結 果

2.1 檢測結果的重復性 每次實驗設立的對照菌株H37Rv減毒株在同一VNTR位點的擴增片段大小相同。從檢測樣本中隨機選取20個菌株，每株不同VNTR位點檢測3次，每次DNA擴增片段大小形同。

（5）完善項目庫的建設。項目庫是預算管理的基礎和支撐，對項目庫實行常年開放和滾動管理。一是強化項目庫約束。未納入項目庫管理的項目，原則上不予安排預算資金。二是做好日常項目編報和管理。對于經論證通過的項目，應及時納入項目庫，成熟一個，編報一個，并依據“輕重緩急”排序。一旦學校有專項資金到達，財務部門就可以依據到達的資金額度和項目排序安排預算，改變以往臨時申報、評審、立項的做法，大大提高資金的下達效率。

2.2 VNTR多態性檢測 本實驗共選取15個特異VNTR位點對大理地區61株合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌進行基因分型，結果顯示不同菌株的DNA指紋圖譜顯示出明顯的多態性。不同菌株在MIRU26和Mtub29位點的多態性檢測結果見圖1、圖2。

M:100 bp DNA maker; H:Standard strains H37Rv; s1-s30:Sample.

M:100 bp DNA maker; H:Standard strains H37Rv; s31-s45:Sample.

2.3 各位點分辨力 各個位點分分辨指數(HGI)詳見表1。VNTR位點的分辨力與HGI值成正比，本研究顯示15個位點的分辨力存在較大差異，15個VNTR位點當中HGI指數最高為0.839，最低為0.341。根據Solac等[7]研究報告，不同VNTR位點的分辨力分為高、中和低3種，高分辨力HGI﹥0.7，中分辨力0.4≤HGI≦0.7，低分辨力HGI<0.4。據此本研究高分辨力位點有MIRU10、MIRU26、MIRU40、Mtub21、Mtub30、Mtub39、MIRU31、Mtub4；中分辨力位點有MIRU39、MIRU27、MIRU23、MIRU2；低分辨力的位點有ETR-B、Mtub29、MIRU4。

表1 15個VNTR位點HGI指數

Tab.1 Hunter-Gaston index of the fifty variable number tandem repeat

LocusHGILocusHGILocusHGIMIRU10Mtub21Mtub29MIRU4MIRU310.7450.7970.3520.3410.824MIRU26Mtub30MIRU39ETR-BMIRU230.8390.7800.6610.3870.622MIRU40Mtub39MIRU27MIRU2Mtub40.7460.7350.6930.6120.772

2.4 MLVA基因分型 采用Bionumerics(6.6)軟件，對61株雙重感染者臨床分離菌株的數字化信息進行聚類分析，生成相應基因發育樹見圖3。根據UPGMA樹狀圖基因分型結果，大理地區61株合并HIV雙重感染者臨床肺結核分離菌株和1株標準株減毒株共分為5個基因群62個基因型，其中Ⅰ型占51.6%(32/62)，包括32個基因型；Ⅱ型占29.0%(18/62)包括18個基因型；Ⅲ型占11.3%(7/62),包括7個基因型；Ⅳ型占6.5%(4/62),包括4個基因型；Ⅴ型占1.6%(1/62),包括1個基因型。其中Ⅰ型為雙重感染者主要的流行基因型，H37Rv減毒株則在Ⅱ型。

2.5 北京家族基因型 將61株合并HIV雙重感染者結核分枝桿菌臨床分離株和1株H37Rv減毒株的15個特異VNTR位點重復次數與http：//www.miru-vntrplus.org網站數據庫中參比，對比得出菌株大致所屬種群。通過對比得出全61株合并HIV雙重感染者臨床分離株北京家族基因型占66%(40/61),非北京家族基因型占34%(21/61)；Ⅰ型菌株中北京家族基因型19株占59%，非北京家族基因型13株占41%。

圖3 61株雙重感染者結核分枝桿菌BioNumerics6.6聚類分析圖(UPGMA)

Fig.3 Sixty-one combined disease strains ofM.tuberculosisBioNumericse 6.6 clustering analysis diagram

3 討 論

MLVA基因分型技術是結核病分子流行病學研究的重要工具，彌補了傳統流行病學的不足。對結核病的爆發流行時檢測傳染源、檢測結核病的傳播、區別內源性和外源性感染、分析某地區流行的結核分枝桿菌基因型以及實驗室污染等方面研究有著重要的意義[8]。

在MLVA基因分型中，VNTR位點的選擇尤為重要。本實驗選取國際上推薦的15位點組合，結果顯示出明顯的遺傳多態性。每一特異VNTR位點多態性由其HGI值決定，所以本研究15位點多態性由低到高依次為MIRU4、Mtub29、ETR-B、MIRU2、MIRU23、MIRU39、MIRU27、Mtub39、MIRU10、MIRU40、Mtub4、Mtub30、Mtub21、MIRU31、MIRU26。其中前3個位點屬于低分辨力組但保守性高；分型過程中分型的差別主要是有高分辨力組的8個位點決定的，且此8個高分辨力位點對于基因的成簇性起著至關重要的作用；而中等分辨力組的4個位點主要作用是提高多位點聯合分析的穩定性和精確基因群的分類。研究中發現同一位點的分辨力的高低。

在不同研究中差異較大，這種結果可能與地域人和群差異有關[9]。本實驗選取的15位點組合總的HGI大于0.99，初步證實這一組合方案適用于該地區結核分枝桿菌基因分型。

據之前的研究報道北京家族基因型結核分枝桿菌毒性高、傳播速度快且播散的范圍廣，所以在以后大理地區合并HIV雙重感染者的結核分枝桿菌研究中應注重北京家族基因型的研究，找出特異性更高的遺傳標記物，確保能夠及時發現及時控制；加大研究的范圍和樣本量更進一步準確的得出更為科學嚴謹的結論；由于不同VNTR位點的分辨力不同所以不同位點組合之間分辨也是有差別[10-11],且目前國際上沒有一更明確的組合標準，所以之后的研究應增加不同的位點組合進行對比分析找到真正適合于大理地區的結核分枝桿菌基因分型位點組合。

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MLVA basedMycobacteriumtuberculosisclinical isolates genotyping analysis from HIV co-infection patients in Dali area, China

NIE Heng,WANG Xu-dong,WU Li-xian

(TeachingandResearchSectionofMicrobiologyandImmunology,DepartmentofBasicMedical,DaliUniversity,Dali671000,China)

A new method based on the multiple locus variable number tandem repeat analysis (MLVA) was applied for the genotyping of combined HIVMycobacteriumtuberculosisin Dali to investigate the genotyping and distribution pattern ofMycobacteriumtuberculosisclinical isolates with MLVA.Mycobacteriumtuberculosisclinical isolates were selected from Dali area, and the polymorphism of VNTR locus was tested with PCR. The clustering of genotype was analyzed by BioNumerics(6.6). Result showed that 15 VNTR loci of 61 combined HIVMycobacteriumtuberculosisclinical isolates were analyzed respectively. There were obvious polymorphisms of VNTRs. The discrimination power of these loci appeared different from each other, with the biggest Hunter-Gaston index (0.839) loci was MIRU26, and the smallest one (0.341) loci was MIRU4. The clustering of genotype showed that these strains could be categorized into 5 gene clusters and 61 genotype, the proportions of cluster Ⅰ was the biggest one, 51.6% were cluster Ⅰ which including 32 strains. The standard strain H37Rv was belongs to cluster Ⅱ. Its indicated that there are obvious polymorphisms of VNTRs of combined HIVMycobacteriumtuberculosisclinical isolates in Dali. The main genotype was Beijing family genotype.

Mycobacteriumtuberculosis; genotype; c-infection; HIV; MLVA

Wu Li-xian, Email:w-lixian@163.com

國家自然科學基金項目(No.81260456)

吳利先，Email：w_lixian@163.com

大理學院基礎醫學院微生物學與免疫學教研室，大理 671000

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.10.006

R378.91

A

1002-2694(2015)10-0923-04

2015-04-13；

2015-08-04

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81260456)