四翼無刺線蟲形態和分子鑒定

高正琴，岳秉飛

四翼無刺線蟲形態和分子鑒定

高正琴，岳秉飛

目的 四翼無刺線蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲病的病原，其對實驗動物的感染危害嚴重。然而，缺乏有效檢測鑒定四翼無刺線蟲的技術。本研究目的是建立四翼無刺線蟲診斷方法，為國家標準的修訂提供科學依據。方法 應用直接鏡檢法對腸道中的四翼無刺線蟲進行篩查。應用多重PCR和測序技術鑒定四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA。結果 采用直接鏡檢實時動態顯微視頻技術在腸道中檢出數量眾多的四翼無刺線蟲蟲卵、幼蟲和成蟲。根據四翼無刺線蟲的卵細胞、幼蟲、雌雄成蟲的大小和形態來鑒定蟲種。應用多重PCR和測序技術從分離獲得的四翼無刺線蟲中鑒定出特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA，與其他不同種寄生蟲無交叉反應。SPF和清潔級實驗動物四翼無刺線蟲感染率分別為41.5%和40.8%。結論 直接鏡檢法和多重PCR結合測序技術能夠快速準確檢測鑒定出四翼無刺線蟲。實驗動物在四翼無刺線蟲的傳播中可能起著重要的儲存作用。因此，需要考慮該寄生蟲的潛在健康危害，以防傳染人類。

四翼無刺線蟲；直接鏡檢；多重PCR；測序

四翼無刺線蟲(Aspiculuristetraptera)隸屬于線蟲綱(Class Nematoda)、尖尾目(Order Oxyurida)、尖尾科(Family Oxyuroidea)、無刺屬(Genus Aspiculuris)，又稱蟯蟲(Pinworm)，可引起蟯蟲病(enterobiasis)，呈世界性分布，寄生于腸道，生活史屬直接型，輕度感染時無明顯癥狀，嚴重時引起糞便嵌塞、直腸脫垂、腸套疊和腸炎等疾病，糞檢發現蟲卵或尸檢發現蟲體即可確診[1-3]。

近年來，SPF(Specific Pathogen-Free，無特定病原體)和清潔級實驗動物已廣泛應用于食品藥品生物制品醫療器械的檢定和研究。中華人民共和國國家標準(GB/T 14922.1-2001)規定：蠕蟲是SPF和清潔級實驗動物均應排除的寄生蟲項目之一，但國家標準中未見四翼無刺線蟲的檢測方法[4-5]。因此，快速準確檢測四翼無刺線蟲是一個重要問題。目前，尚未見不同方法檢測鑒定SPF和清潔級實驗動物四翼無刺線蟲的報道和有效數據。本研究應用直接鏡檢和多重PCR(multiple-PCR)結合多基因測序技術，對SPF和清潔級實驗動物四翼無刺線蟲感染進行檢測鑒定和調查研究，為國家標準的修訂提供技術支撐和參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器設備 生物安全柜(Thermo Fisher Scientific，美國)；LEICA DM2500生物顯微鏡(Leica Microsystems，德國)；倒置顯微鏡及成像系統(Nikon，日本)；二氧化碳培養箱(北京五洲東方科技發展有限公司)；基因擴增儀(Applied Biosystyem，美國)；凝膠成像分析系統(東樂自然基因生命科學公司)。

1.2 樣品來源 293只SPF和清潔級實驗動物來自18個生產廠家。安樂死后采腸樣本待檢。

1.3 直接鏡檢 取待測樣本，放入潔凈離心管中，加入生理鹽水，輕輕吹打混勻，室溫孵育30 min；棄上清，沉淀以生理鹽水重新懸浮，室溫孵育20 min；棄上清，沉淀以生理鹽水重新懸浮，室溫孵育15 min；棄上清，沉淀以生理鹽水充分混勻，吸取混合液滴片，直接鏡檢，采用實時動態顯微視頻攝錄結果。根據蠕蟲的蟲卵、幼蟲、成蟲的形態和大小來進行蟲種的鑒定。

1.4 蟲體和蟲卵離體生存能力試驗 取待測樣本，放入潔凈離心管中，加入磷酸鹽緩沖液，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min，1 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀重新以磷酸鹽緩沖液吹打懸浮，小心收集數條鮮活蟲體和數只蟲卵，放置于新鮮配制的含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養液中，37 ℃ 5% CO2實驗條件下放置，倒置顯微鏡下觀察蟲體和蟲卵存活狀態，實時拍攝記錄結果。

1.5 多重PCR和測序 針對四翼無刺線蟲的特定基因nd1(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基1，NADH dehydrogenase subunit 1)、nd5(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶亞基5，NADH dehydrogenase subunit 5)、cox1(細胞色素C過氧化物酶亞基1，cytochrome c oxidase subunit 1)、cytb(細胞色素b，cytochrome b)、ITS2(內轉錄間隔區2，internal transcribed spacer 2)和28S rRNA(28S核糖體核糖核酸，28S ribosomal RNA)設計六對引物。多重PCR引物名稱、序列和產物大小見表1。同上收集待測樣本中數條鮮活蟲體，放置于潔凈離心管中，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作提取樣品基因組DNA。以抽提的待測蟲體樣本DNA為模板，同時用隱匿管狀線蟲(Syphaciaobvelata)、鼠管狀線蟲(Syphaciamuris)DNA作為多重PCR陰性對照。PCR總反應體系為50 μL，包括10 × Buffer (Mg2+Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(1.0 μmol/μL)各0.5 μL、EX Taq(5 U/μL)0. 25 μL、模板DNA 5.0 μL、nuclease-free water 34.75 μL。循環參數：94 ℃ 1 min 1 cycle；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，40 cycles；72 ℃ 10 min 1 cycle。瓊脂糖凝膠電泳檢測多重PCR擴增產物。陽性樣本作測序鑒定。

2 結 果

2.1 直接鏡檢結果 吸取SPF和清潔級實驗動物腸樣本中鮮活蟲體，快速滴片，實時動態顯微視頻攝錄記載蟲體形態特征及運動方式：鏡下觀察，可見數量眾多的外觀略呈無色透明的鮮活蠕蟲蟲體游走蠕動，處于不同分化時期的蟲卵和幼蟲數量較多。雌蟲長2.86～3.97 mm，口孔在蟲體頭部頂端，有3個唇瓣環繞，口孔兩旁有明顯的半橢圓形的頭泡。頭部有寬的頸翼，頸翼膜起自頭泡、終于食道基部。食道前部呈棒狀，后為一卵圓形食道球(圖1)。卵巢2條，起始于食道基部。陰門開口于蟲體中部，子宮壁粗厚，子宮內有成熟卵(圖2)。尾部呈圓錐狀(圖3)。雄蟲長2.13～3.64 mm，有寬尾翼，無交合刺和引器(圖4)。蟲卵無色透明，呈對稱的橢圓形，大小為(86～97)μm×(37～49)μm，內含物為桑椹期胚細胞，胚細胞與卵殼間有空隙，卵殼薄(圖5)。依據蠕蟲蟲體的形態、大小、構造和蟲卵的形狀、大小、顏色、卵殼特征，鑒定為四翼無刺線蟲。

2.2蟲體和蟲卵離體生存能力試驗結果 將從待測樣本中收集到的四翼無刺線蟲蟲體和蟲卵，37 ℃ 5% CO2實驗條件下放置，結果發現：在37 ℃四翼無刺線蟲離體至少能夠存活兩周。第8 d時，四翼無刺線蟲蟲卵具胚胎(圖6)。第10 d時，四翼無刺線蟲雌蟲顯得倦怠行動遲緩(圖7)，雄蟲活力減弱尚可運動(圖8)。第14 d后，四翼無刺線蟲蟲體已無自主運動能力，出現死亡。

表1 多重PCR引物

圖1 四翼無刺線蟲雌性成蟲前部

圖2 四翼無刺線蟲雌性成蟲腹部

2.3 多重PCR結果 在上述收集到的實驗動物數條鮮活蟲體樣品中均檢測出四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因特異性DNA片段(大小分別為405 bp、435 bp、561 bp、282 bp、397 bp和600 bp)，而作為陰性對照的隱匿管狀線蟲、鼠管狀線蟲樣本卻未觀察到目的基因片段擴增。圖9顯示的是實驗動物四翼無刺線蟲多重PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果。實驗動物四翼無刺線蟲多重PCR擴增獲得了清晰特異的nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因目的條帶。實驗動物四翼無刺線蟲nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因序列測定分析結果與國際上已公布的四翼無刺線蟲基因序列同源性為100%(GenBank登錄號為KF444331.1，KF444351.1，KF444311.1，KF444291.1，KJ143618.1和KF771644.1)。分子鑒定結果證明實驗動物自然感染的確實是四翼無刺線蟲。

圖3 四翼無刺線蟲雌性成蟲尾部

圖4 四翼無刺線蟲雄性成蟲尾部

圖5 四翼無刺線蟲蟲卵

圖6 實驗動物四翼無刺線蟲蟲卵在37℃ 5% CO2第8 d鏡檢形態

Fig.6 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapteraegg isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 8

圖7 實驗動物四翼無刺線蟲雌性成蟲在37℃ 5% CO2第10 d鏡檢形態

Fig.7 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapterafemale adult isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 10

圖8 實驗動物四翼無刺線蟲雄性成蟲在37 ℃ 5% CO2第10 d鏡檢形態

Fig.8 Microscopy morphology ofAspiculuristetrapteramale adult isolated from laboratory animal under 37℃ for 5% CO2on day 10

圖9 多重PCR擴增實驗動物四翼無刺線蟲nd1(405 bp)、nd5(435 bp)、cox1(561 bp)、cytb(282 bp)、ITS2(397 bp)和28S rRNA(600 bp)基因特異性DNA片段瓊脂糖凝膠電泳

Fig.9 Agarose gel electrophoresis of multiplex PCR products amplified by primers targeted nd1 (405 bp), nd5 (435 bp), cox1 (561 bp), cytb (282 bp), ITS2 (397 bp) and 28S rRNA (600 bp) genes specific DNA of genomic DNA extracted fromAspiculuristetrapteraisolated from laboratory animal

結果顯示，直接鏡檢法和多重PCR結合測序技術均能檢測出四翼無刺線蟲。在SPF和清潔級實驗動物中檢出數量眾多的四翼無刺線蟲蟲體和蟲卵，鑒定出四翼無刺線蟲特定基因nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因。13個生產廠家31批195只SPF實驗動物四翼無刺線蟲檢出率41.5%(81/195)。5個生產廠家10批98只清潔級實驗動物四翼無刺線蟲檢出率40.8%(40/98)。

3 討 論

Behnke[6]報道英國野鼠四翼無刺線蟲感染發病率達56%。Kia[7]報道伊朗野鼠四翼無刺線蟲感染率達11.8%。Pritchett[8]報道北美普通級實驗小鼠四翼無刺線蟲感染率為0.19%。Bazzano[9]報道巴西普通級實驗動物四翼無刺線蟲感染率達8.5%。Dole[10]報道美國SPF級實驗小鼠四翼無刺線蟲感染率達9.2%。我們的研究調查結果顯示我國SPF和清潔級動物四翼無刺線蟲感染率分別為41.5%和40.8%。實驗動物寄生蟲感染可為人體感染寄生蟲病起到一定的儲存和傳播病原的作用，在流行病學上具有重要意義。人獸共患病名錄中人獸共患寄生蟲病69種，我國存在60種[11-13]。最近我國時有SPF實驗動物因人獸共患寄生蟲感染致死的報道[14-15]。由此可見，我國實驗動物感染人獸共患寄生蟲的現狀不容樂觀，實驗動物攜帶的人獸共患寄生蟲病原體，不僅污染環境、飲水、飼料、墊料、空氣，同時也對人類健康造成危害，已污染的實驗動物用于食品藥品生物制品醫療器械檢定后果不堪設想。因此，實驗動物生產廠家和飼養繁育單位一定要重視人獸共患寄生蟲病原體的生物安全性問題，一定要及時對已污染實驗動物的糞便、墊料、籠器具等進行徹底的滅菌消毒并作無害化處理，避免污染公共水源和周邊環境，強化公共衛生安全防控意識，保護人民身體健康，保障人民用藥安全。

Hsieh[16]報道四翼無刺線蟲蟲卵能在水中具胚胎，這一特征可使其在宿主體外依然有生存力。Phillipson[17]報道四翼無刺線蟲感染潛伏期為21～25 d，幼蟲在結腸內孵化，成蟲遷移到遠端結腸前逗留3～5 d，一條成年雌性四翼無刺線蟲平均每天產卵17個，5～8 d后成為感染性蟲卵，雌性四翼無刺線蟲壽命為45～50 d。本文作者在37℃ 5% CO2實驗條件下研究發現，四翼無刺線蟲蟲卵在體外第8 d時具胚胎有感染性，雌性和雄性成蟲離體能存活兩周。本研究獲得的寄生蟲可作為模式生物，用于抗寄生蟲藥物篩選研究，也可作為人類寄生蟲疾病動物模型制備材料，用于寄生蟲致病機理的深入研究。

Parel[18]報道用核糖體rDNA基因作為鑒定四翼無刺線蟲的靶基因，但在PCR擴增后還需要酶切電泳，操作繁瑣易污染。而我們的研究則將經典的形態學檢查鑒定方法和最新的分子生物學檢測鑒定方法結合起來應用于實驗動物四翼無刺線蟲感染診斷調查，首先采用直接鏡檢實時動態顯微視頻技術監測實驗動物腸道四翼無刺線蟲，獲得了雌雄成蟲、幼蟲和蟲卵獨特形態構造寶貴視頻資料；同時應用多重PCR和測序技術對分離獲得的四翼無刺線蟲成蟲、幼蟲和蟲卵進行多基因特征的確證，鑒定核實了四翼無刺線蟲特定的nd1、nd5、cox1、cytb、ITS2和28S rRNA基因，可作為今后四翼無刺線蟲檢測鑒定的靶標，獲得的多位點基因數據可用于四翼無刺線蟲遺傳多樣性研究，為國家標準的修訂提供了技術支撐和參考依據。

歐洲實驗動物學會聯合會[19]制定了統一的歐洲標準，規定實驗小鼠、大鼠、地鼠、沙鼠、豚鼠、兔必檢無刺線蟲屬。日本中央實驗動物研究所實驗動物質量控制標準規定必檢四翼無刺線蟲。隨著我國經濟發展和對外交流增加，實驗動物在生物醫藥研究領域中作用也愈顯重要，因此，適應全球經濟一體化，研究國外標準，以我國實驗動物寄生蟲監測調研基礎數據作為科學依據，修訂完善國家標準顯得非常必要，這需要更多確定的研究予以支持。

綜上所述，直接鏡檢法和多重PCR結合測序技術能夠快速準確檢測鑒定出四翼無刺線蟲。四翼無刺線蟲是一種重要的人獸共患寄生蟲病的病原，其對實驗動物的感染危害嚴重。實驗動物在四翼無刺線蟲的傳播中可能起著重要的貯存作用。因此，需要考慮該寄生蟲的潛在健康危害，以防傳染人類。

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Morphological and molecular identification ofAspiculuristetraptera

GAO Zheng-qin,YUE Bing-fei

(NationalInstitutesforFoodandDrugControl,Beijing100050, China)

Aspiculuristetrapterais a pathogen of parasitic zoonoses, which is one of the most harmful parasites infecting laboratory animals. However, limited data are available on an effective technique for detection and identification ofAspiculuristetraptera. The aim of this study is to develop the method for diagnosis ofAspiculuristetraptera. It could provide a scientific basis for revision of national standard. Direct examination of intestines was performed to screen forAspiculuristetraptera. Moreover, multiplex-PCR and sequencing were applied to identify the parasite by constructing species-specific primers that were designed for unique regions of the nd1, nd5, cox1, cytb, ITS2 and 28S rRNA genes ofAspiculuristetraptera. Results showed that numerous ofAspiculuristetrapterawere detected in intestines by direct microscopy using real-time dynamic microscopic video.Aspiculuristetrapterawas speciated based on the morphology and size of ovum, larvae, female and male adult worm. Multiplex-PCR and sequencing were performed to identify nd1, nd5, cox1, cytb, ITS2 and 28S rRNA genes of DNA extracted from the parasite identifiedAspiculuristetraptera. This approach allowed their specific identification with no amplicon being amplified from heterogeneous DNA samples, and sequencing confirmed the identity of the sequences amplified. Direct microscopy, multiplex-PCR and sequencing can be used to detect and identifyAspiculuristetraptera. Of the SPF and cleaning laboratory animals studied,Aspiculuristetrapterawere presented overall frequencies of 41.5% and 40.8%, respectively. Direct microscopy, multiplex-PCR and sequencing are effective techniques with high specificity and sensitivity and could serve as useful tools for detection and identification ofAspiculuristetraptera. Laboratory animals may serve as an important reservoir for transmission ofAspiculuristetraptera. Therefore, the potential health hazard of the parasite needs to be considered to prevent infectivity of humans.

Aspiculuristetraptera, direct microscopy, multiplex-PCR, sequencing

Yue Bin-fei, Email: gaozhengqin@126.com

岳秉飛，Email: gaozhengqin@126.com

中國食品藥品檢定研究院，北京 100050

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.009

R383

A

1002-2694(2015)07-0635-05

2015-01-15；

2015-05-20