結核病生物標記物研究進展

于夢夢，孫 林

結核病生物標記物研究進展

于夢夢，孫 林

結核病是由結核分枝桿菌復合群所致的以呼吸系統感染為主的慢性傳染病，傳統的檢測方法檢出率低、漏診率高，導致結核菌繼續傳播和病人治療延誤。因此，迫切需要發現新的結核病診斷標志物以建立快速、敏感、高效的結核病診斷方法，而生物標記物正可以達到此目的。結核病中的某些生物標記物還具有治療的作用，有些生物標記物可用于研制TB疫苗。對生物標記物不斷深入的研究將有利于理解結核病的發生發展過程。本文就結核病中的生物標記物作一綜述。

結核?。簧飿擞浳?；診斷

結核病(tuberculosis, TB)是由結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex, MTC)引起的一種以呼吸系統感染為主的慢性傳染病，該病嚴重威脅人類健康并且給畜牧業造成了巨大的經濟損失。目前全球約有1/3的人口感染結核桿菌，2012年新發的活動性結核病人有860萬人，有近130萬人死于結核病。結核分枝桿菌感染人體后一般會產生3種結果：約5%的感染者能夠在體內完全清除細菌；5%～10%的感染者會發展成臨床結核病患者；90%感染者長期攜帶病原菌成為潛伏感染者。大部分感染者保持潛伏感染狀態一生都不會發病，只有當機體免疫狀況出現問題或者反復感染時，其中5%～10%的人會發展為結核病。潛伏感染不斷轉化為活動性結核是造成結核病發病率居高不下的重要原因，而HIV感染、TNF-α中和抗體治療以及糖尿病等的出現又大大增加了潛伏感染者罹患臨床結核病的概率，潛伏感染為結核病的診斷和控制帶來了巨大的挑戰。國際上唯一得到官方認可的用于結核病防治的疫苗卡介苗(BCG)，只能對兒童起到有效的保護，對成人的保護效果不理想，這些都給人類結核病防控造成了巨大障礙。目前用于結核病診斷的方法主要有胸部X光攝片、細菌培養等檢測方法，但傳統的檢測方法周期長、檢出率低、漏診率高，導致結核菌繼續傳播和病人治療延誤。因此，迫切需要發現新的結核病診斷標志物，建立快速、敏感、高效的結核病診斷方法，結核病特異性生物標記物應運而生。

1 多種多樣的生物標記物

生物標記物(biological marker or biomarker)是一種可以被測定或評價的，具有對生理過程、病理過程或治療有藥理學反應特點的指示物[1]，是近年來隨著免疫學和分子生物學技術的發展而提出的，它不僅可從分子水平探究發病機制，而且在準確、敏感地評價早期、低水平損害方面有著獨特的優勢，可提供早期預警和判斷治療或預防的反應，很大程度上為臨床醫生提供了輔助診斷的依據。機體最終發展成為活動性結核還是形成耐受，生物標記物能夠提供兩者之間的聯系。最有價值的生物標記物能夠測定一種疾病，包括其發病機制和保護機制，并且在早期治療過程中每一個變化都能與藥理學和藥物動力學的干預聯系起來?？梢宰鳛門B的生物標記有多種類型，如細胞因子、免疫細胞表面分子、炎癥標志物、細胞表面受體和抗體等。

收集不同地區人群的外周血并分離PBMC，用ESAT-6、Rv2031和HBHA(Rv2031和HBHA被認為是結核分枝桿菌在潛伏感染期間產生的)刺激PBMC后測定IFN-γ的分泌水平。結核潛伏感染患者(LTBI)和急性結核病人都對ESAT-6有強烈反應。但是，只有LTBI對Rv2031或HBHA反應比較強烈，這種差異是由急性結核病人中Treg細胞的抑制反應所引起的[5]。非T細胞或非常規T細胞的數量也存在潛在信息，如果可溶性腫瘤壞死因子受體1(sTNFR1)水平上升、白細胞總量增加、單核細胞核和嗜中性粒細胞絕對數量也增加，綜合上述變化則可準確判定出療效不佳的病人。

炎癥標志物可作為TB的生物標記物。分析結核病患者接受治療時的反應，發現C反應蛋白(CRP)、可溶性尿激酶纖溶酶原激活物受體(suPAR)、可溶性細胞間粘附分子1(sICAM-1)、顆粒蛋白酶B和LAG-3的水平與肺泡受累程度相關，特別是與空洞的數量和大小相關[7]。這些標記中，CRP是一種急性期蛋白，可以調理多種病原體，促進巨噬細胞的吞噬作用，因此CRP表達增加可作為炎癥和細菌感染的標志物。TB患者血清中CRP升高，治療后其水平降低。

細胞表面受體也可作為TB的生物標記。在被結核分枝桿菌感染的單核細胞中可溶形式suPAR上調，可能是因為suPAR參與轉化生長因子β1[6]的活化，潛在抑制對結核分枝桿菌的免疫反應。與CRP相似，血清中suPAR的水平與結核分枝桿菌感染個體的不良預后相關，治愈后suPAR水平會下降。suPAR水平也可用來評估HIV預后，因此對于艾滋病和結核共感染個體，suPAR上升則意味著預后不良。

2 傳統診斷方法以及TST與IGRAs比較

結核病的高死亡率與現今結核病診斷方法不足有一定的關系。對于結核病的診斷，傳統方法如痰涂片、分離培養、胸片和皮試反應，已經運用了幾十年。但這些方法在HIV流行的地區有很大局限性，因此發展更加準確和簡便的診斷方法十分迫切[8]。

結核菌素實驗(tuberculin skin test, TST)最早出現在1890年，是最古老的檢測手段。自從TST發明以來，人類一直用TST來診斷結核分枝桿菌的潛伏感染[9]。

結核分枝桿菌潛伏感染不具有活動性結核病的臨床特征和癥狀，現在主要通過檢測宿主對結核分枝桿菌菌體蛋白產生的免疫反應來判斷是否發生結核分枝桿菌感染。TST使用PPD(Purified protein derivative)作為抗原，檢測機體產生的細胞介導的遲發型超敏反應。PPD的一些抗原在結核分枝桿菌、卡介苗和非結核分枝桿菌中都存在[9]，因此它們之間會產生交叉反應，造成假陽性結果，比如BCG免疫的個體。在免疫力低下的人群中，TST的敏感性較低，比如AIDS和營養不良人群。不過，通過定期跟蹤TST結果，可以對近期轉陽的人群進行干預治療[10]。近來TST更有被特異性的免疫學方法所替代的趨勢，即體外檢測結核分枝桿菌抗原特異性的IFN-γ釋放水平(Interferon-γ release assays, IGRAs)。IGRAs是近年來出現的第一個代替TST的檢測方法。IFN-γ可作為細胞免疫診斷的分子標記，利用T細胞具有記憶性，當T細胞遇到結核的抗原時，如果能夠分泌出大量IFN-γ[11]，就證明T細胞曾經接觸過結核抗原，從而推斷出機體感染過結核。最初使用PPD作為抗原檢測IFN-γ，近來更偏向于使用結核分枝桿菌特異性抗原，比如ESAT-6和CFP-10。這兩個蛋白由結核分枝桿菌RD1區編碼，BCG缺失此區域，因此基于結核特異性抗原ESAT-6 和 CFP-10 的IGRAs可以區分BCG接種和結核感染，但仍無法區分活動性結核與潛伏性感染[12]?；诖思夹g已經發展出兩個商業化的試劑盒：QuantiFERON-TB assay (Cellestis Limited, Carnegie, Victoria, Australia)和the TSPOT-TB assay(Oxford Immunotec, Oxford, UK)，與TST相比有更好的特異性和敏感性[13]，但是IGRAs在結核病流行地區和高危人群(AIDS)的應用還存在一些問題。在結核病流行地區，健康人群使用IGRAs檢測IFN-γ的釋放，其值會高于IGRAs商品化標準。對于AIDS來說，由于感染了HIV會減少IFN-γ產生。針對這些情況IGRAs可能會有不同的檢測標準[14]。

3 治療過程中的標志物

宿主免疫與臨床標記在治療的早期階段是更好的指示劑，能夠反映促炎反應和抗炎反應之間平衡的恢復，因此可與疾病的嚴重程度關聯起來。雖然宿主的促炎標志物不是結核分枝桿菌特異的，但是在一個特定的臨床條件下可與結核分枝桿菌特殊的標記物聯合起來進行解釋說明。盡管在治療結核過程中用重組牛分枝桿菌BCG 32 kDa蛋白(亦稱Ag85A)刺激外周血單核細胞實驗中IFN-γ水平上升，但IGRAs尚未證明可以用來監控治療的成功與否[20]。相比之下，IL-10水平降低，IFN-γ/IL-10的比值上升與治療成功相關，也能夠區別活動性或潛伏性結核[21]。與此類似，IL-4和它相對的剪接變體IL-4δ2的比值在結核病治療過程中上升，在結核病早期治療過程中IL-4/ IL-4δ2比值發生變化，并可以預測預后[22]。

結核病會復發，即便是看似已經成功治愈的病人也會復發，甚至能夠在完成規范治療兩年后復發。復發率范圍估計為5%～15%[15]。雖然經常與不遵守治療方案有關，但復發也會發生在遵循治療方案的患者中，識別出那些處于危險中的人能夠加強資源的利用，防止治療效果不佳。結核病治療后，某些T細胞群體(只分泌IFN-γ的T細胞，分泌IFN-γ和IL-2的T細胞，分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的T細胞)的頻率在潛伏性感染個體中會發生改變。也有一些新的關于復發免疫標記的研究，開始治療后血清中IP-10(interferon-inducible protein 10)和IL-17水平與痰涂片陽性培養結果相關，治療后兩個月時血清中IP-10水平可預測復發風險，而IL-17可以預測死亡率[16]。

4 新生物標記物的發現

利用基因組、蛋白質組和代謝組學方法可進行高通量篩選，這使得確定新的生物標記成為可能。現在常利用轉錄組學發現新的生物標記物。結核病人與健康人中基因差異表達的概念是比較新的，最近的一項研究結合微陣列和qRT-PCR方法將40位結核病人與37位潛伏感染個體的外周血單核細胞基因表達進行比較[17]。差異性分析顯示僅有一組參與了微生物防御和細胞內運輸的3個基因(CD64，乳鐵蛋白和Rab33)能夠鑒別出活動性結核病人和潛伏感染個體。

為了確定分枝桿菌及其宿主蛋白，蛋白質組學技術已經被用于結核病的研究，這些蛋白都有可能作為生物標記，如結核分枝桿菌培養濾液中的Rv3369和Rv3874能夠通過血清學試驗區分結核病人和健康對照組，其敏感性達到60%～74%，特異性為96%～97%[23]。Sartain等使用類似的方法確定了4種結核分枝桿菌抗原(PstS1、HspX、MPT64和TrxC)能夠通過血清學試驗區別空洞型和非空洞型肺結核患者[18]。我們迫切需要新的生物標記物來診斷結核病和監測治療，以補充ESAT-6、CFP-10和Ag85這3種眾所周知的T細胞抗原[24]?，F在仍缺乏充足的的診斷能力從健康個體中鑒別出患有活動性疾病的的病人或者提供治療上的監測[25]。鄧教宇等[26]利用釀酒酵母系統可溶表達結核分枝桿菌蛋白并點制成蛋白芯片，利用芯片尋找血清中的生物標記物以評估治療效果。通過比較189位患有活動性結核病并且未開始接受治療的病人與150位已康復的結核病人(在治療前為涂片陽性，接受了6個月完整的抗菌治療后涂片呈陰性)的血清抗體，發現活動性結核病人中Rv324、Rv0537c、Rv1685c、Rv2072c、Rv3899c、Rv1100、Rv1865c、Rv3881c、MT0124、Rv2884、MT3959、Rv2564和Rv1654等13種抗體水平顯著高于康復組，而 GroEL (Rv0440)抗體水平則明顯低于康復組。這些生物標記物的發現有利于治療過程的監測，可能實現個體化治療，根據個人對治療反應水平不同，隨時調整治療方案。

代謝組學利用質譜技術在血清或尿液等體液中的小分子代謝物中尋找疾病生化指標或者藥物治療的生物標志物。代謝組學有助于深入研究生物標志物，是對基因組和蛋白質組技術手段的補充，雖然現已公布的TB生物標記沒有利用這種方法發現的，但是代謝組學在一些其他疾病中已顯現出巨大的應用價值，因此有充分的理由相信代謝組學也必將助力結核病生物標記物的發現[19]。利用宿主和結核分枝桿菌的代謝物也許能發現宿主病原特異性與疾病狀態及治療反應之間的聯系，有可能預測最后的結果。現在生物標記研究面臨最大的挑戰是如何對轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學研究獲得的數據進行分析、整合和解釋。

5 挑戰和未來方向

具有保護性作用的結核生物標記的應用將大大促進和加速TB疫苗的開發。鑒別活動性結核和潛伏性結核的生物標記也在不斷地發現。但也存在了許多困難亟待解決。有兩種標志物對結核病有重大影響，一是需要確定早期結核病的生物標記物，二是疫苗引起預防抵抗TB的生物標記物。在生物標記物能夠替代疫苗引起的預防作用之前，必須進行臨床試驗。保護性和/或疾病早期的結核病生物標記物需要跨越地域并在不同種族人群中進行驗證；也要在共感染瘧疾、寄生蟲和HIV的人群中進行驗證，然而困難遠遠不止這些。目前主要的障礙和限制在于了解結核病的發病機制以及新的解決方案制定和策略建議的提出，這也為未來的研究指明了方向。

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Biomarkers of tuberculosis

YU Meng-meng,SUN Lin

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseasesandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Tuberculosis (TB) is a chronic disease caused byMycobacteriumtuberculosiscomplex(MTBC) and exhibits as respiratory infection in most cases. The low detection rate and high misdiagnosis rate from traditional methods result in TB spreading and treatment delaying. Therefore, there is an urgent need to find new TB biomarkers, which can be utilized to explore rapid, sensitive and efficient methods for TB diagnosis. Biomarkers of TB are also useful for tuberculosis treatment and some biomarkers can be used to develop TB vaccines. Biomarker research will help us understand TB pathogenesis. This review will summarize the biomarkers of tuberculosis and their applications.

tuberculosis; biomarker; diagnosis

Sun Lin, Email: sunlin@yzu.edu.cn

國家青年科學基金(31201882)和江蘇省高校自然科學基金(12KJB230001)聯合資助

孫林，Email: sunlin@yzu.edu.cn

揚州大學，江蘇省人獸共患病學重點實驗室，江蘇省重要動物疫病與人獸共患病防控協同創新中心，揚州 225009

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.07.017

R392.1

A

1002-2694(2015)07-0674-04

2014-09-10；

2015-03-05

Supported by the National Science Foundation for Young Scientists of China (No. 31201882) and the Natural Science Foundation of the Jiangsu Higher Education Institutions (No.12KJB230001)