米根霉AS 3.819基因啟動子片段的克隆及功能鑒定

張 旻，姜紹通*，鄭 志，潘麗軍，李興江，羅水忠，吳學鳳

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

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米根霉AS 3.819基因啟動子片段的克隆及功能鑒定

張 旻，姜紹通*，鄭 志，潘麗軍，李興江，羅水忠，吳學鳳

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽省農產品精深加工重點實驗室，安徽 合肥 230009）

摘 要：從L-乳酸生產菌米根霉（Rhizopus oryzae）菌株AS 3.819基因組DNA中分別擴增得到了乳酸脫氫酶基因（ldhA）、丙酮酸脫氫酶基因（pdcA）、淀粉糖化酶基因（amyA）以及磷酸甘油酸酯激酶基因（pgk1）的啟動子片段，并構建啟動子探針載體pUKMR，以β-內酰胺酶基因（bla）為報告基因在大腸桿菌JM109中對這些啟動子片段進行篩選及啟動活性檢測。結果表明：4 種啟動子片段成功啟動報告基因表達；在非底物誘導情況下，ldhA和pgk1啟動子啟動活性較強；在有合適碳源底物誘導情況下pdcA和amyA啟動子擁有更高的啟動活性；ldhA基因的啟動子啟動活性隨著啟動子片段長度的增加有一定提高，而在長度為500 bp以上時，其啟動活性變化不明顯。本研究為Rhizopus oryzae提供了一種快速簡便的啟動子捕獲分離及啟動活性檢測方法。

關鍵詞：米根霉；大腸桿菌；啟動子探針載體；β-內酰胺酶；乳酸脫氫酶

米根霉（Rhizopus oryzae）是一種重要的工業微生物，能夠利用葡萄糖等己糖、木糖等戊糖、淀粉及木質纖維素等碳源生產高純度L-乳酸[1-6]及其他有機酸[7-8]，在食品、醫藥、化學工業、皮革、香料等領域具有廣泛的用途。同其他許多絲狀真菌一樣，由于培養條件簡單，具有高效的分泌表達系統以及易于實現大規模連續發酵等優點，米根霉也有著應用于同源或者異源蛋白表達，成為一種高效基因工程菌的潛力。但是由于穩定可靠的針對野生型或者工業米根霉菌株的遺傳轉化方法尚未發展成熟，對米根霉的遺傳改造工作目前仍然存在較大的難度。

啟動子是基因表達調控的重要元件，對于基因表達水平有著重要的影響。隨著絲狀真菌遺傳改造研究越來越深入，越來越多的真菌基因的啟動子被分離及鑒定，并被應用于真菌表達質粒的構建當中。對于米根霉而言，獲取高效穩定或者可調控的啟動子對于米根霉表達載體構建也是十分重要的。啟動子片段的分離一般采用啟動子探針質粒捕獲的方法，包括從基因組文庫篩選以及從聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增產物中篩選啟動子片段，而啟動子片段的克隆方法又包括常規PCR法、反向PCR法、鍋柄PCR法、序列特異性引物PCR法、熱不對稱交錯PCR法和Y型接頭擴增法等[9]。啟動子探針質粒依靠其中的報告基因對啟動子片段進行篩選以及功能分析[10-13]。在啟動子探針質粒構建當中，常常選擇綠色熒光蛋白（green fluorescent protein）基因[14]、β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）基因[15]及β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucoronidase）基因[16]作為報告基因。另外一種類型的啟動子探針載體則是以抗性標記基因作為報告基因，包括氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因等[17-20]。

本研究以pUC18克隆載體為載體構建基礎，β-內酰胺酶（β-lactamase）基因bla（氨芐青霉素抗性基因）為報告基因構建探針質粒。應用此探針載體在大腸桿菌JM109當中進行米根霉基因啟動子的篩選，并通過測定轉化子氨芐青霉素耐受性，β-內酰胺酶活性，檢測并比較幾種啟動子片段的啟動活性，以期為米根霉或其他絲狀真菌的啟動子片段快速簡便的捕獲分離方法提供參考。

1　材料與方法

1.1菌株

米根霉（Rhizopus oryzae）AS 3.819菌株 中國科學院微生物研究所（菌種保藏編號：CICC40313）；大腸桿菌Escherichia coli JM109 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2質粒

本研究所用到的質粒均列于表1中。

表1　本研究所用質粒Table 1 Plasmids used in this study

1.3試劑與儀器

1.3.1 試劑

rTaq DNA聚合酶，DNA限制性內切酶SspⅠ、NdeⅠ、EcoRⅤ和SmaⅠ，T4連接酶，DNA Marker，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside， IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactoside，X-Gal）、去磷酸化酶（alkaline phosphatase）來自于E. coli C75以及pUC18載體 日本TaKaRa公司；硫酸卡那霉素（kanamycin）北京Solarbio公司；氨芐青霉素（ampicillin） 美國Amersco公司；β-內酰胺酶標準品 美國Sigma公司；青霉素鉀鹽 中國藥品生物制品檢定所；PCR產物膠回收純化試劑盒 美國Axygen公司；質粒小量抽提試劑盒以及pEASY-T1克隆載體試劑盒 北京全式金生物工程有限公司；Amicon Ultra-15超濾管及超濾膜 美國Merck Millipore公司。

1.3.2 儀器與設備

TC-96 PCR儀 杭州博日科技有限公司；Universal HoodⅡ凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；Himac CR22GⅡ高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；TU-1901紫外分光光度計 北京普析分析儀器公司。

1.4引物

根據米根霉基因組序列數據庫（http://www. broadinstitute.org/annotation/genome/rhizopus_ oryzae/MultiHome.html）中公布的各個基因的旁側序列，設計引物ldhpF以及ldhpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點）擴增ldhA基因的啟動子區域片段PldhA；設計引物pdcpF以及pdcpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點）擴增pdcA基因的啟動子區域片段PpdcA；設計引物amypF及amypR（兩端引入EcoRⅤ酶切位點）擴增amyA基因的啟動子區域片段PamyA；設計引物pgkpF以及pgkpR（兩端引入SmaⅠ酶切位點）擴增pgk1基因的啟動子區域片段Ppgk1；根據pEASY-T1質粒的序列設計引物KmrU（引入SspⅠ及EcoRⅤ酶切位點）及KmrD（引入NdeⅠ酶切位點）從pEASY-T1質粒上擴增卡那霉素抗性基因及其上下游序列。以上引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。引物序列列于表2中。

表2　PCR所用引物及其序列Taabbllee 2 Primers used for PCR process and their sequences

1.5方法

1.5.1 米根霉基因啟動子片段分離

從米根霉斜面上制取孢子乳懸液，并按體積分數5%的接種量接種到培養基中。米根霉培養所用培養基成分如下：葡萄糖120 g/L、硫酸銨4 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L、磷酸二氫鈉0.3 g/L、硫酸鋅0.44 g/L、硫酸鎂0.25 g/L。32 ℃振蕩培養12 h左右。當培養液中有均勻分散的米根霉菌絲體時便可取出進行基因組DNA的提取。

米根霉菌體基因組提取過程參照分子克隆實驗指南有關內容并加以改進[21]。以基因組DNA為模板進行各個啟動子片段的擴增。擴增片段的回收純化、連接、轉化大腸桿菌、質粒提取、酶切及回收等過程參考分子克隆實驗指南。

1.5.2 啟動子探針載體的構建

啟動子探針質粒的骨架來源于pUC18克隆載體見表1。用限制性內切酶SspⅠ以及NdeⅠ酶切pUC18質粒，切除368 bp含有β-內酰胺酶基因的啟動子的片段，使此基因無法表達，并獲得含有SspⅠ及NdeⅠ酶切黏性末端的線性質粒。同時將用引物KmrU及KmrD擴增并克隆得到的1.1 kb帶有卡那霉素抗性基因（kan）的表達盒片段與其進行連接（此片段5’端含SspⅠ及EcoRⅤ酶切位點，3’端含NdeⅠ酶切位點），轉化大腸桿菌并用40 μg/mL的卡那霉素進行篩選，由此得到探針質粒pUKMR。此質粒的原SspⅠ酶切位點相鄰處存在由引物引入的EcoRⅤ位點，可通過此酶切位點插入待篩選的平末端啟動子片段，并可能啟動β-內酰胺酶基因的表達，使宿主菌獲得氨芐青霉素抗性。

1.5.3 米根霉基因啟動子在大腸桿菌E. coli JM109中的啟動活性檢測

1.5.3.1 啟動子片段的篩選

構建的啟動子探針質粒經過酶切、去磷酸化處理之后回收，與同樣經過酶切回收的啟動子片段進行過夜連接并轉化大腸桿菌E. coli JM109，以氨芐青霉素為抗性標記篩選得到含重組質粒的抗性轉化子。挑選抗性轉化子菌落于含50 μg/mL的氨芐青霉素的液體LB培養基中培養并提取質粒，并通過PCR檢測及測序檢測確認是否連入了啟動子片段。

篩選并鑒定出的轉化子經培養之后采用平板劃線的方式接種于含不同質量濃度（50、80、100、150、180、200、220、250、300 μg/mL）的氨芐青霉素的固體LB平板上，觀察β-內酰胺酶基因在各個啟動子片段啟動作用下的表達導致轉化子對氨芐青霉素的耐受性，并由此初步考察這幾種啟動子片段的啟動活性。

1.5.3.2 β-內酰胺酶活力檢測

β-內酰胺酶活力檢測參考文獻[22]方法，取對氨芐青霉素具有抗性的上述菌落，接種在含有40 μg/mL的卡那霉素的50 mL的LB液體培養基中，于37 ℃、180 r/min搖瓶培養18 h達到對數生長后期收集菌液。8 000 r/min離心10 min，收集培養上清液，通過Amicon Ultra-15超濾管（超濾膜截留分子質量10 000 D）超濾濃縮10 倍至5 mL。濃縮后的上清用以測定β-內酰胺酶活力。酶活力測定采用以青霉素鉀為底物，2,2’-聯喹啉為顯色劑的方法，在分光光度計下檢測反應后顏色對比計算樣品中β-內酰胺酶活力。測定方法如下：1 mL含5 000 U/mL青霉素鉀的醋酸鹽緩沖液（20 mmol/L，pH 6.0）中加入0.1 mL濃縮上清樣品，37 ℃反應1 h。反應結束后添加1 mL的13 g/100 mL三氯乙酸溶液，混合均勻后于4 000 r/min離心10 min，取上清0.2 mL，添加0.05 g/100 mL的2,2’-聯喹啉4.8 mL，混合均勻后添加20 mmol/L的CuSO4溶液0.4 mL，混合均勻室溫靜置顯色15 min后，在分光光度計中于550 nm波長處測定吸光度，空白對照中樣品替換為等量LB液體培養基。并以β-內酰胺酶標準品制作酶活力-質量濃度標準曲線，計算濃縮樣品酶活力（U/mL）。1.5.3.3 蛋白質含量測定

測定1.5.3.2節中濃縮處理得到的培養上清液中的可溶蛋白質含量，測定方法參照Bradford法[23]。

2　結果與分析

2.1基因啟動子片段克隆

圖1　米根霉AS 3.819基因啟動子片段PCR擴增產物Fig.1 PCR amplification products of gene promoter fragments from R. oryzae AS 3.819

以米根霉AS 3.819基因組DNA為模板，ldhpF及ldhpR為引物擴增PldhA片段，得到約250 bp大小的特異性條帶（圖1A）；pdcpF及pdcpR為引物擴增PpdcA片段，獲得約1 000 bp大小的特異性條帶（圖1B）；amypF及amypR為引物擴增PamyA片段，獲得約900 bp大小的特異性條帶（圖1C）；pgkpF及pgkpR為引物擴增Ppgk1片段，獲得約500 bp大小的特異性條帶（圖1D）。從電泳結果來看，與設計中4 條片段的260、1 080、896、541 bp長度相符合。4 條片段送往生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果對比NCBI以及米根霉基因組序列數據庫相應片段的序列，結果表明擴增片段序列正確。

2.2啟動子探針質粒的構建與鑒定

如1.5.2節部分所述，本研究中所構建的探針載體pUKMR在其β-內酰胺酶編碼基因的上游缺失啟動子部分，此載體無法使宿主獲得氨芐青霉素抗性。只有在此位點插入具有啟動功能的片段才能重新讓β-內酰胺酶編碼基因在其調控之下進行表達，并通過氨芐青霉素抗性篩選出轉化子。

A圖：1. 250 bp DNA Ladder Marker標準，2. 含kan基因的表達盒片段的PCR產物；B圖：1. 250 bp DNA Ladder Marker標準，2. pUKMR質粒提取，3、4. pUKMR質粒EcoR Ⅴ單酶切后產物，5. DL15000 DNA Marker標準。

圖 22 kkaann基因表達盒PCR擴增與質粒pUUKKMMRR的EEccooRⅤ單酶切鑒定結果

Fig.2 PCR amplification of kan gene and restriction enzyme digestion

test of plasmid pUKMR with EcoRⅤ

卡那霉素抗性基因（kan）是以pEASY-T1質粒為模板擴增獲得的（圖2A），替換pUC18載體上的β-內酰胺酶編碼基因（bla）的啟動子部分構建成pUKMR質粒。通過卡那霉素抗性篩選出轉化子，將轉化子分別接種于含40 μg/mL卡那霉素及含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中進行比較，結果轉化子能在含40 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中生長，而無法在含50 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中生長，說明篩選出的轉化子確實已經不具備氨芐青霉素抗性了，可以認為探針載體pUKMR的bla上游是缺失啟動子的。質粒經過EcoRⅤ限制性內切酶單酶切并回收后將產生的平末端進行去磷酸化處理，獲得帶平末端的探針載體，便可與同樣平末端的啟動子片段進行連接。從經過EcoRⅤ限制性內切酶單酶切后產生的線性載體的電泳結果來看，大小與預期的3 349 bp大小相符合（圖2B）。

2.3各啟動子片段在大腸桿菌E. coli JM109中的啟動功能

2.3.1 啟動子的篩選及其啟動活性比較

由于在PldhA、PpdcA、PamyA及Ppgk1片段的兩端引入了EcoRⅤ或SmaⅠ位點，因此通過EcoRⅤ或SmaⅠ酶切獲得帶平末端的啟動子片段。通過T4連接酶將其與去磷酸化的線性平末端探針載體pUKMR過夜連接，之后轉化大腸桿菌E. coli JM109，并且通過50 μg/mL的氨芐青霉素進行篩選，獲得了pUK-PldhA、pUK-PpdcA、pUK-PamyA及pUK-Ppgk1轉化子。轉化子質粒分別經過了PCR和酶切驗證，表明啟動子片段都已插入到了探針載體pUKMR上并替換了β-內酰胺酶基因原來的啟動子。

將成功轉化pUK-PldhA、pUK-PpdcA、pUK-PamyA及pUK-Ppgk1重組質粒而獲得氨芐青霉素抗性的轉化子分別采用平板劃線的方式接種于含有50、80、100、150、180、200、220、250、300 μg/mL氨芐青霉素的固體LB平板上于37 ℃培養12 h，經過抗性檢測比較3 種轉化子對氨芐青霉素的耐受能力，并以轉化pUC18質粒的E. coli JM109為對照。由表3可知，轉化入pUK-PldhA的轉化子可以耐受最高達200 μg/mL的氨芐青霉素，而使用pUK-PpdcA以及pUK-PamyA得到的轉化子其耐受氨芐青霉素能力均比pUC18轉化子低，在150 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板中已經無法生長，這4 種轉化子中以pUK-Ppgk1轉化子耐受性最高，能耐受高達250 μg/mL的氨芐青霉素。

表3　含不同啟動子的轉化子對氨芐青霉素的耐受性Table 3 Ampicillin resistance of recombinants containing different promoters

2.3.2 含啟動子片段的轉化子β-內酰胺酶活性比較

圖3　不同啟動子作用下表達的β-內酰胺酶活性Fig.3 Activity of β-lactamase expressed under the control of different promoters

篩選出的含4 種啟動子的重組轉化子，分別經過含40 μg/mL卡那霉素的LB培養基培養后，按照1.5.3.2節方法測定轉化子分泌的β-內酰胺酶活力。如圖3所示，含不同啟動子的轉化子其胞外蛋白中β-內酰胺酶的活力及比活力均有所差別，其表達的β-內酰胺酶量有所差別，間接可以反映出各個啟動子啟動β-內酰胺酶基因表達強度的不同。其中以攜帶pgk1基因啟動子的轉化子其表達的β-內酰胺酶活性最高，其次為含ldhA啟動子的轉化子。而amyA及pdcA基因啟動子在此條件下啟動能力低于pUC18中原β-內酰胺酶基因bla自帶的啟動子。此結果與2.3.1節中各個轉化子對氨芐青霉素的耐受性比較結果相吻合。通過此結果可以得知，在LB培養基的培養條件下，啟動子啟動能力為Ppgk1＞PldhA＞PpdcA＞PamyA，其中PamyA和PpdcA啟動能力低于pUC18中自帶的啟動子。

2.4啟動子在不同碳源下的啟動活性

微生物代謝過程中，許多碳代謝相關途徑中的關鍵酶的表達往往會受到培養底物的誘導或抑制，其原因之一可能是由于代謝底物自身或者代謝中間物對于相關酶基因啟動子區域上的元件的作用使得基因的表達得到增強或抑制，這也是微生物發酵代謝調控的重要基礎之一。基因表達類型分為誘導型表達、組成型表達和組織特異型表達，主要取決于啟動子啟動基因表達的模式。其中誘導型表達的基因其啟動子在培養過程中未添加誘導物的情況下，不啟動基因表達或者以一定的水平進行本底表達。這在代謝調控研究中有著十分重要的意義，可是使微生物在不同生長條件下合理分配代謝流量在代謝網絡中的分布，節省自身能量消耗并且充分利用資源。

在包括米根霉在內的絲狀真菌中，碳代謝網絡相關的部分酶蛋白基因的表達類型屬于誘導型表達，其表達量隨底物中碳源的不同存在很大的區別。從2.3.2節結果得知，在LB培養基培養條件下amyA和pdcA基因啟動子啟動bla表達的能力較低。本研究比較了在不同碳源作為培養底物情況下各啟動子的啟動活性的變化。在含不同質量濃度梯度氨芐青霉素的LB篩選培養基中各添加了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油及淀粉至終質量濃度為5 g/L，分別在這些平板上劃線接種含不同啟動子的宿主菌株，觀察生長情況。如表4～7所示，PpdcA和PamyA在不同碳源底物誘導作用下表現出一定的啟動活性差別，使得宿主大腸桿菌氨芐青霉素耐受性出現變化。其中PpdcA啟動活性在葡萄糖和蔗糖中得到了一定的提升，在淀粉和麥芽糖中啟動活性與普通篩選LB相比無顯著變化，而在甘油中其啟動活性喪失，宿主菌無法在含有甘油的LB篩選平板上生長。PamyA則在淀粉中啟動活性表現出較高的增強，在葡萄糖及蔗糖中啟動活性有一定的增加，在甘油及麥芽糖中啟動活性與普通LB篩選培養基中相比基本無差別。相比之下，PldhA和Ppgk1的啟動活性則受碳源底物種類的影響則不大，除甘油中Ppgk1啟動活性受到較大影響外，其他篩選培養基下生長狀況和普通LB篩選培養基中無明顯區別。

表4　不同碳源底物下含llddhhAA基因啟動子的轉化子對氨芐青霉素的耐受性Table 4 Ampicillin resistance of recombinants containing ldhA promoter with different carbon substratess

表5　不同碳源底物下含pdcA基因啟動子的轉化子對氨芐青霉素的耐受性Table 5 Ampicillin resistance of recombinants containing pdcA promoter with different carbon substratess

表6　不同碳源底物下含aammyyAA基因啟動子的轉化子對氨芐青霉素的耐受性TTaabbllee 66 Ampicillin resistance of recombinants containing aammyyAA promoter with different carbon substratess

表7　不同碳源底物下含ppggkk11基因啟動子的轉化子對氨芐青霉素的耐受性TTaabbllee 7 Ampicillin resistance of recombinants containing ppggkk11 promoter with different carbon substrates

此外，依照1.5.3.2節的方法，在各添加了葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘油及淀粉至終質量濃度為5 g/L的含40 μg/mL卡那霉素的液體LB培養基中培養宿主菌，分析其表達的β-內酰胺酶活性。如圖4所示，含PamyA的宿主菌在淀粉及葡萄糖中其表達的β-內酰胺酶活性確實得到了很大的提高，同樣含PpdcA的宿主菌在葡萄糖和蔗糖中β-內酰胺酶活性也有提升，而含PldhA和Ppgk1的宿主菌除在甘油條件下以外，隨著碳源底物改變其啟動表達的β-內酰胺酶活性變化不大。因此對比2.3節部分所得出的結果，可以認為米根霉的amyA及pdcA基因屬于誘導型表達，其基因啟動子的啟動活性受到碳源底物的誘導及抑制作用的調控，其在各自強誘導底物的作用下啟動活性達到相對較高水平。

圖4　不同碳源底物下4 種啟動子啟動表達的β-內酰胺酶活性Fig.4 Activity of β-lactamase expressed under the control of four promoters with different carbon substrates

2.5ldhA基因啟動子片段長度對于啟動活性的影響

本實驗研究了未曾應用于真菌表達載體構建的乳酸脫氫酶A（ldhA）基因啟動子，對其啟動活性進行了檢測。同時也發現這種啟動子啟動活性相較其他的啟動子（包括受到誘導情況下的PamyA和PpdcA）并不高。除了在本研究所設置的誘導條件下啟動活性未表現出受誘導的現象之外，其相對較短的長度也有可能會致使其啟動能力未得到完全的發揮。因此本研究對ldhA啟動子片段長度進行了增加，搜尋了ldhA上游序列中合適的擴增位點，分別使用上游引物ldhpF2、ldhpF3、ldhpF4、ldhpF5以及下游引物ldhpR擴增了長度分別為529、777、1 104、1 363 bp的ldhA啟動子片段（分別為PldhA2、PldhA3、 PldhA4、PldhA5），并連入了啟動子探針質粒pUKMR中。通過50 μg/mL的氨芐青霉素篩選出抗性菌落，并經過40 μg/mL的卡那霉素和50 μg/mL的氨芐青霉素驗證以及PCR驗證后得到連入啟動子的轉化子。

在非誘導條件下對含有不同長度ldhA啟動子片段的宿主的氨芐青霉素耐受性和表達β-內酰胺酶活性分別進行比較。如表8和圖5所示，當ldhA啟動子片段長度由260 bp增加到529 bp時，啟動子片段的啟動活性有些許增強，而繼續增加啟動子其啟動活性卻不再增加，整體看來ldhA啟動子長度的增加對于bla基因在大腸桿菌中表達的增強并不十分明顯。

表8　含不同長度的llddhhAA啟動子片段的轉化子對氨芐青霉素的耐受性Taabbllee 8 Ampicillin resistance of recombinants containing llddhhAA promoter fragments of different lengths

圖5　不同長度的llddhhAA啟動子片段作用下表達β-內酰胺酶活性Fig.5 Activity of β-lactamase expressed under the control of ldhA promoter fragments of different lengths

3　結論與討論

本研究從米根霉菌株AS 3.819基因組中克隆了4 種基因ldhA、pdcA、amyA和pgk1的啟動子片段，將其重組入構建的啟動子探針載體pUKMR中，并以大腸桿菌為宿主，篩選、檢測并比較啟動子的啟動活性。通過比較結果認為，在非底物誘導情況下，Ppgk1和PldhA片段均可以作為強啟動子應用于構建米根霉真菌表達載體。而在有合適碳源底物誘導情況下PpdcA和PamyA擁有更高的啟動活性，也可作為誘導型強啟動子得到應用。ldhA基因的啟動子啟動活性隨著啟動子片段長度的增加，啟動活性有一定的提高，而在長度為500 bp以上時，其啟動活性不再增加。

對于工業生產菌株而言，了解其相關的分子生物學信息對于菌種改造、發酵性能優化、提高其工業應用有著十分重要的意義。通過基因遺傳轉化技術為基礎的代謝工程改造方法是常用的手段，而遺傳改造所使用的基因表達載體的構建，除了要選擇合適的篩選標記外，適用于宿主菌的高效穩定或者能夠進行人為調控的基因啟動子也是不可或缺的。在真菌當中，糖化酶基因（amy）和磷酸甘油酸酯激酶基因（pgk）的啟動子作為真菌基因的強啟動子得到研究與應用[16,24-26]，而且由于兩種基因的表達類型的不同（amy為誘導型表達，pgk為組成型表達），可以分別在不同的培養條件下達到調節基因表達強度的目的。而丙酮酸脫羧酶基因（pdc）在包括米曲霉在內的絲狀真菌中是表達強度最高的基因之一[27]，因此其啟動子也可作為強啟動子用于外源基因在米根霉內的強表達。pdcA、amyA和pgk1這幾種基因的啟動子片段也分別代表著幾種不同類型的啟動子，在發酵過程當中，對于不同培養條件其啟動基因表達也會做出不同的響應。在米根霉表達載體構建中應用這幾種不同類型的啟動子米根霉構建不同類型的表達載體，對應著不同的發酵底物，如發酵玉米淀粉（主要碳源底物為淀粉），或者秸稈水解糖（主要含葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等單糖）及葡萄糖，能夠使得表達載體中的目的基因或者篩選標記基因的表達得到一定的調控，特異性地增強目的基因的表達或者在普通發酵條件下針對性地“關閉”篩選標記基因的表達（降低篩選標記基因的持續表達對宿主米根霉轉化子造成的代謝負擔）。而本研究中所涉及到的乳酸脫氫酶基因（ldh）啟動子目前未有報道對其進行過研究。米根霉是一種重要的有機酸生產菌株，米根霉AS 3.819轉化底物碳源為L（＋）-乳酸的轉化率高，其丙酮酸代謝節點的代謝流量進入乳酸代謝支路的關鍵酶是乳酸脫氫酶。因此本研究對ldhA基因啟動子的啟動活性進行了研究，對其不同啟動子片段長度的啟動能力做了比較，為選擇適當的ldhA啟動子片段長度提供了參考。另一方面，在本研究中，ldhA啟動子活性受碳源底物的影響并不明顯，可能說明ldhA基因表達為組成型而非誘導型，但也有可能是因為ldhA基因的表達強度受其他培養底物或者相關代謝途徑中的代謝中間物而非碳源底物的影響。其啟動子啟動基因表達確切的類型仍需進一步研究。

應用啟動子探針載體對擁有啟動功能的DNA片段進行捕獲分離是一種常用的啟動子研究手段。目前包括米根霉在內的部分絲狀真菌還未建立十分高效穩定且適用范圍較廣的遺傳轉化體系，米根霉的主要遺傳轉化方法也是基于營養缺陷型篩選標記，應用于野生及工業應用的米根霉菌株尚且存在困難[13,28]，在這些絲狀真菌中進行傳統的啟動子探針質粒的轉化往往得不到理想的效果，給啟動子研究帶來不便。目前已有研究將絲狀真菌的啟動子在細菌中啟動目的標記基因的表達用以研究其啟動表達性能[20,29]，且仍有部分啟動子保留其啟動基因表達的類型，說明這些絲狀真菌的基因啟動子即使在某些其他的宿主中仍然能有著其基本的啟動功能。基于此考慮本研究所構建的啟動子探針載體將米根霉的啟動子用于在大腸桿菌中啟動β-內酰胺酶基因（bla）的表達，并檢測了啟動子的啟動活性。通過這種方法的建立，為米根霉或其他絲狀真菌的啟動子片段快速簡便的捕獲分離方法提供參考與借鑒。當然由于啟動子在不同的宿主當中的作用應當要考慮宿主的基因表達特性以及目標基因的特異性，篩選所得到的啟動子的在米根霉或者絲狀真菌中啟動基因表達的可靠性以及具體的效果仍需要進一步的驗證。在本研究的基礎上，將進一步建立并發展米根霉遺傳轉化方法，并且依靠這種遺傳轉化方法更深入地分析各種啟動子片段在米根霉中的基因啟動特性，為米根霉遺傳改造工作提供更多理論依據。

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Cloning and Functional Characterization of Gene Promoters from Rhizopus oryzae AS 3.819

ZHANG Min, JIANG Shaotong*, ZHENG Zhi, PAN Lijun, LI Xingjiang, LUO Shuizhong, WU Xuefeng
(Key Laboratory for Agricultural Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Abstract:In this paper, promoter fragments of four genes, lactate dehydrogenase A (ldhA), pyruvate decarboxylase A (pdcA), glucoamylase A (amyA) and phosphoglycerate kinase 1 (pgk1), from genome DNA of Rhizopus oryzae strain AS 3.819, were amplified and screened in Escherichia coli strain JM109 by using promoter probe vector pUKMR containing β-lactamase gene (bla) as its reporter gene. The results suggested that the four promoter fragments all possessed the ability to drive the expression of the β-lactamase gene. The promoters of ldhA and pgk1 genes possessed high promoting strength even though no inducing substrate was present, while the strength of pdcA and amyA promoters could be enhanced when the suitable carbon source was adopted. The strength of ldhA promoter was enhanced as the fragment length increased until it reached 500 bp. This research provides a quick and easy method to isolate and detect gene promoters form Rhizopus oryzae.

Key words:Rhizopus oryzae; Escherichia coli; promoter probe vector; β-lactamase; lactate dehydrogenase

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507014

中圖分類號：Q789

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0071-08

*通信作者：姜紹通（1954—），男，教授，本科，研究方向為食品發酵工程、大宗農產品資源生物轉化加工和油脂加工工程。E-mail：zming19861028@hotmail.com

作者簡介：張旻（1986—），男，博士研究生，研究方向為微生物發酵與生物技術。E-mail：zming19861028@126.com

基金項目：國家自然科學基金面上項目（31071636；31171741；31470002）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31101352）

收稿日期：2014-11-08