羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白 的抗原反應特性分析

張靜怡，吳文惠，王南平，何 蘭，Elango JEEVITHAN，包 斌,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 2013 06；3.上海市水產研究所，上海 200433）

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羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白 的抗原反應特性分析

張靜怡1，吳文惠2，王南平3，何 蘭3，Elango JEEVITHAN1，包 斌1,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 2013 06；3.上海市水產研究所，上海 200433）

摘 要：目的：確定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性，為進一步研究羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白生物相容性提供依據。方法：采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對分離提取的羅非魚皮膠原蛋白進行鑒定，共免疫ICR小鼠3 次。采用酶聯免疫吸附反應（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）分別于每次免疫后第7天測定小鼠產生的總膠原蛋白抗體，并在第21天測定小鼠血清中內免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白M（IgM）的含量。結果：羅非魚皮膠原蛋白樣品是Ⅰ型膠原蛋白。所有經羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫的小鼠體內均產生抗體，3 次免疫后羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗體質量濃度范圍為160.50～164.25 μg/L，小鼠IgG、IgA和IgM的質量濃度范圍分別為424.81～437.59 ng/mL、46.86～49.53 μg/mL、1.81～1.89 ng/mL。結論：羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白對ICR小鼠呈現較弱的抗原性。

關鍵詞：膠原蛋白；免疫；酶聯免疫吸附反應；抗原性

膠原蛋白作為哺乳動物體內含量最豐富的蛋白質，約占體內蛋白總量的25%～33%，并且在組成細胞間質過程中起重要作用[1-2]。膠原蛋白廣泛存在于動物的皮、骨、軟骨、牙齒、肌腱、韌帶和血管中，具有支撐器官、保護機體的重要作用[3]。膠原蛋白三螺旋結構，由2 條α1多肽鏈和1 條α2多肽鏈組成，3 條α肽鏈交互纏繞形成了繩索狀的超螺旋結構[4]。每一條膠原鏈都是左手螺旋構型，3 條左手螺旋鏈相互纏繞成右手螺旋結構，形成膠原蛋白獨特的三重螺旋結構，使其分子結構非常穩定[5]。膠原蛋白具有良好的生物相容性、可生物降解性和生物活性[6]。因此，膠原蛋白在食品、醫藥、組織工程、化妝品等領域獲得廣泛的關注，膠原蛋白的生產與開發具有很好的前景[7]。

長期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發，對牲畜膠原制品的安全性產生了影響[8-10]。另外，有些地區由于其他人文原因不能使用牲畜膠原蛋白制品。由此，魚類膠原蛋白逐漸成為了研究熱點[11]。我國水產資源豐富，魚類膠原蛋白屬天然生物再生資源，可以作為一種新型的生物醫學材料廣泛應用[6,12-13]。與陸生動物膠原蛋白相比，魚類膠原蛋白具有許多獨特優勢。而羅非魚是一種分布廣泛、產量較高的魚類品種，被認為是未來動物性蛋白的主要來源之一，近年來逐步受到重視。

然而，魚類膠原蛋白的安全性仍然是關鍵問題?？贵w是在宿主對抗原刺激的免疫應答過程中，由淋巴細胞產生的一類能夠特異性識別 并中和相應抗原的具有免疫功能的球蛋白?？乖允强?原刺激機體產生免疫應答的能力?？乖宰鳛樯锊牧习踩缘年P鍵因素，其強弱與抗原分子的大小、化學成分、抗原決定簇的結構、抗原與被免疫動物親緣關系的遠近等有密切關系。膠原蛋白的分子質量較大，在應用于生物材料過程中可能會產生抗原性問題。膠原蛋白對于宿主是異物，在體內必定會產生某種應答或出現排異現象[14-15]。如果要成功植入膠原蛋白，至少要使發生的免疫反應被宿主接受，不產生有害作用。而被免疫的動物會通過特異 性和非特異性的免疫防御機制來維持機體的正常功能及自身內環境的穩定。因此，進行羅非 魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗原性的檢測是十分必要的。通過測定被免疫動物血清中的抗體含量，評價其免疫狀況，對判斷羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白生物相容性具有重要意義。

Song等[16]為了研究水母膠原蛋白是否會產生類似牛膠原蛋白或明膠引起的炎癥反應，進行了體內植入實驗，測定了促炎細胞因子和抗體分泌物的表達并檢測了免疫細胞的數量變化情況。結果顯示水母膠原蛋白可以引起與牛膠原蛋白和明膠類似的免疫反應。本實驗以ICR小鼠作為動物模型，采用酶聯免疫吸附反應分析測定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白誘導小鼠產生抗體的特性及其相關指標的變化特點[17]，從而確定羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性強弱，以便為該種膠原蛋白材料在生物工程領域的應用提供基礎。

1　材料與方法

1.1動物、材料與試劑

SPF級ICR雌性小鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（滬）2008-0016。小鼠飼養在相對濕度60%～70%、溫度20～25 ℃、自然晝夜溫差的環境內，每日定時飼喂常規飼料，每日更換墊料。

羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白由上海水產研究所提供。所有提?、裥湍z原蛋白的實驗操作均在4 ℃條件下進行。羅非魚魚皮經浸提、離心、透析和冷凍干燥等步驟獲得干燥的羅非魚酶溶性膠原蛋白（tilapia pepsin soluble collagen，TPSC）。

三羥甲基氨基甲烷（t r i s h y d r o x y m e t h y l aminomethane，Tris）（分析純） 瑞典LKB公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、過硫酸銨（ammonium persulphate，AP）、甘氨酸、四甲基乙二胺、氯化鋁、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍R250 上海標本模型廠；小鼠抗Ⅰ型膠原蛋白抗體酶聯免疫吸附反應（enzyme linked immune sorbent assay，ELISA）試劑盒、小鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG）ELISA試劑盒、IgA ELISA試劑盒、IgM ELISA試劑盒 上海撫生實業有限公司；0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器 上海安譜科學儀器有限公司。

1.2儀器與設備

DYY-2c型電泳儀 北京六一儀器廠；SH-1000型酶標儀 上海天美儀器有限公司；CR21G型高速冷凍離心機 日本Hitachi公司；電泳凝膠成像分體系統 美國UVP公司。

1.3方法

1.3.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳（sodium dodecyl su lfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分析

采用SDS-PAGE測定羅非魚皮膠原蛋白分子質量，主要參照Laemmli[18]的方法進行。濃縮膠質量分數為5%，分離膠質量分數為7.5%，250 V電壓電泳約1 h至終點。固定液固定1 h，考馬斯亮藍R250染色0.5 h，脫色過夜，凝膠成像系統分析成像。

1.3.2 免疫材料的制備

取44 mL 0.6 mol/L氯化鋁溶液加熱至60 ℃，再取42 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液加熱至60 ℃，在60 ℃水浴鍋中將氫氧化鈉溶液緩慢加入氯化鋁溶液中，不斷攪拌1 h。用氫氧化鈉溶液調整混合液的pH值達7.0時為終點，再繼續攪拌10 min，配制得到的氫氧化鋁溶膠佐劑裝入瓶內，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，室溫保存[19-20]。

取羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白0.012 5 g，加入0.1 mol/L乙酸100 mL。注射前經0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器過濾，作為抗原樣品。

蝦類是人類優質的食用蛋白資源之一，也是公認的易引起過敏的食物之一。蝦蛋白作為一種異體蛋白進入體內時，機體易產生免疫反應將其中和及消滅掉。因此本實驗中選用蝦蛋白作為陽性對照[21]。選取10 g斑節對蝦的肌肉在研缽中勻漿，加入0.1 mol/L乙酸100 mL，4 ℃浸提16 h后10 000 r/min、4 ℃離心20 min取上清液，即為蝦總蛋白提取液[22]。經0.25 μm孔徑親水PTFE針式濾器過濾后，蝦總蛋白提取液與氫氧化鋁溶膠佐劑等體積混勻[19-20]，作為陽性對照抗原。

1.3.3 動物分組及免疫

取30 只體質量為20 g左右的雌性ICR小鼠，腹腔注射羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白溶液，進行劑量篩選預實驗。結果表明0.1 mL/d為最佳劑量，因此采用該劑量進行后續實驗。

30 只雌性ICR小鼠隨機分為6 組，每組5只：低劑量處理組、中劑量處理組、高劑量處理組、對照組、膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組，注射量為0.1 mL。各劑量處理組小鼠分別注射羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白5、50、500 μg/kg（以體質量計，下同）；對照組小鼠注射0.1 mol/L乙酸；膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組用氫氧化鋁溶膠佐劑0.05 mL分別與羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白及蝦蛋白0.05 mL混合，注入小鼠體內，以便更有效地刺激免疫系統，增大免疫應答效應[23]。

每隔一周腹腔注射一次，共注射3 次。期間觀察小鼠注射后的癥狀，每次注射后7 d眼眶取血，抗凝條件為檸檬酸鈉3.8%、生理鹽水0.85%。5 000 r/min離心5 min取上清液，－20 ℃貯存備用。提取血清進行ELISA分析。

1.3.4 抗體含量檢測方法

分別于每次免疫后7 d取血，采用小鼠抗羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白抗體ELISA試劑盒，利用具有高靈敏度競爭性ELISA的替代工具雙抗原夾心法，測定小鼠血清中Ⅰ型膠原蛋白抗體（collagen type I antibody，COL-Ⅰ Ab）水平[24]。在已包被的酶標板上，標準孔準確加入標準品50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL。37 ℃溫育30 min后棄去液體，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5 次。每孔加入酶標試劑50 μL（空白孔除外），37 ℃溫育30 min，同上洗滌。經過徹底洗滌后加底物3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）顯色，37 ℃避光顯色10 min，TMB在辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的催化下轉化成藍色。每孔加終止液50 μL終止反應，TMB在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中Ⅰ型膠原蛋白抗體（COL-Ⅰ Ab）含量呈正相關。以空白孔調零，在4 50 nm波長處測定每組小鼠抗體的絕對吸光度。以標準曲線的公式計算小鼠Ⅰ型膠原蛋白抗體含量[25]。

2　結果與分析

2.1SDS-PAGE結果分析

圖1　羅非魚皮膠原蛋白樣品SDS-PAGE圖Fig.1 SDS-PAGE of tilapia skin collagen

如圖1所示，羅非魚皮膠原蛋白含兩條α鏈和它們的聚合鏈β，所得條帶與陳申如等[26-27]的研究結果相似。與Nagai等[28]對3 種魚皮膠原蛋 白的研究結果對比發現，所提取的羅非魚皮膠原蛋白是Ⅰ型膠原蛋白成分。兩條α肽鏈分子質量約為130 kD，β肽鏈分子質量約為116 kD[29]。由3 條α鏈所組成的未變性膠原蛋白分子質量為300 kD，所以β肽鏈可能是α肽鏈通過架橋結合所形成的成分[26]。進行SDS-PAGE時，對加了巰基乙醇和未加巰基乙醇的樣品進行對照（結果未給出），電泳結果沒有區別，推測羅非魚皮膠原蛋白樣 品中沒有包含二硫鍵。

2.2羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原免疫原性測定結果

圖2　羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠的抗體質量濃度Fig.2 Antibody concentrations against tilapia skin type I collagen in mice

在以羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白為抗原的免疫實驗中，所有的小鼠體內均產生抗體。如圖2所示，前兩次免疫分析結果顯示，處理組間比較，中劑量處理組的抗體質量濃度最高，其次為高劑量處理組，最低為低劑量處理組。第3次免疫后高劑量處理組的抗體質量濃度最高，其次為低劑量處理組，最低為中劑量處理組。對比膠原蛋白陽性對照組和蝦蛋白陽性對照組的抗體質量濃度可以發現，前兩次免疫后膠原蛋白陽性對照組產生的抗體質量濃度要高于蝦蛋白陽性對照組，這表明小鼠在接受注射后14 d內對羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的免疫強度較蝦蛋白強。21 d后這種差異性變得不再明顯，這可能是因為21 d后小 鼠對膠原蛋白產生了免疫適應性，導致免疫系統接受膠原蛋白的刺激能力變弱并使免疫循環趨于穩定變化。第3次免疫后所有注射組的抗體質量濃度均降低到最低值，維持在160～163 μg/L的水平。其中，中劑量處理組在第3次免疫后抗體質量濃度明顯降低。

由以上結果可以看出，50 μg/kg的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白注射量會在小鼠體內產生較高的抗體質量濃度。5 μg/kg的注射量在前7 d時產生的抗體質量濃度較低，與對照組相比差異極顯著（P＜0.01），與蝦蛋白陽性對照組相比差異顯著（P＜0.05）。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白首次免疫小鼠產生的抗體量較少，第2次免疫后產生抗體質量濃度有所升高，至第3次免疫產生的抗體質量濃度又顯著降低。這表明低劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白是一種低抗原性的蛋白質。隨著免疫次數的增加，免疫反應強度進一步降低。原因可能是持續的免疫反應使小鼠適應羅非魚皮膠原蛋白的能力得到提升，從而使羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫刺激能力下降。該結果與何創龍等[30]的研究結果相似：運用ELISA間接法檢測植入一種骨膠原材料后兔血清的抗體含量，確定該材料的抗原特性從而得出該材料可引起較低的免疫反應。以上結果表明，羅非魚皮膠原Ⅰ型蛋白可以作為一種蛋白質材料在一定時間內存在于生物體內而不發生嚴重的免疫反應。

2.3羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠產生的IgG、IgA、IgM含量

表1　羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫小鼠的IgG、IgA、IgM質量濃度Table 1 IgG, IgA and IgM concentrations in tilapia skin type Ⅰcollagen-immunized mice

3 次免疫反應后對小鼠體內的IgG、IgA、IgM含量進行酶聯免疫分析法測定。由表 1可知，中劑量處理組的IgG質量濃度顯著高于蝦蛋白陽性對照組（P＜0.05），低、高劑量處理組和對照組在小鼠體內的免疫反應沒有發現顯著差異（P＞0.05）。這說明中劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白可以刺激小鼠免疫系統產生高質量濃度的IgG。其原因可能是低劑量條件下膠原蛋白活潑基團的暴露量較少，IgG在蛋白分子上的吸附量較低，致免作用較弱。當膠原蛋白劑量逐漸增大時，伴隨著膠原蛋白活潑羥基群含量的提升，補體活化作用顯著增強，并刺激小鼠免疫系統產生大量的IgG。而高劑量的膠原蛋白抗原含量較高，會較快地與新產生的IgG免疫球蛋白結合并被吞噬細胞吞噬，從而造成IgG檢測量偏低。對比處理組和陽性對照組，中劑量處理組羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白產生的IgG質量濃度要高于同劑量添加佐劑的蝦蛋白陽性對照組，這表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白在小鼠體內的免疫反應強于蝦蛋白粗提取液。添加佐劑的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白（膠原蛋白陽性對照組）產生的IgG質量濃度最高，這表明佐劑的存在會增強IgG的質量濃度水平從而產生更有效的保護性免疫。在IgA質量濃度測定中，羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白各劑量處理組的IgA質量濃度測定結果與IgG相似，高劑量處理組的IgA質量濃度極顯著低于膠原蛋白陽性對照組（P＜0.01）。中劑量處理組的IgA質量濃度高于高、低劑量處理組。這種情況在IgM的測定結果中更為明顯。膠原蛋白陽性對照組IgM質量濃度低于蝦蛋白陽性對照組，這表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白對IgM產生的影響小于斑節對蝦蝦蛋白。

作為體液免疫系統中重要的免疫效應分子，免疫球蛋白IgG、IgA和IgM在生物體內的含量可以直接體現免疫反應的發生情況[31-32]。侯小萍等[33]研究了Ⅲ型豬膠原蛋白膜免疫實驗兔后IgG、IgM和IgA抗體含量，從而確定其免疫特性，作為鑒定該材料是否可以用于鼓膜移植材料的一個依據。孫澤威等[34]也用類似方法對犢牛血清中大豆抗原特異性抗體IgG的含量進行了ELISA檢測。IgG是體液免疫最重要的一個生物反應指標，它是血清主要的抗體成分，約占血清免疫球蛋白含量的75%。其主要功能是在機體免疫中起保護作用，如抗菌、抗病毒，應對麻疹、甲型肝炎等，能有效地預防相應的感染性疾病。本實驗中羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白引起小鼠體內IgG的變化進一步驗證了羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白具有一定的抗原性[29]。IgA在正常人血清中的含量僅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10%～20%，也常與其他免疫球蛋白抗體一起作為抗原反應特性的依據。血清檢出IgM 提示新近發生感染，可用于早期感染的診斷依據，因此本實驗也對其進行了測定[32]。膠原蛋白陽性對照組的IgA質量濃度高于蝦蛋白陽性對照組，表明羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的抗原性強于斑節對蝦蛋白。并且小鼠體內初次遭遇蛋白質抗原后最早回應出現的循環抗體為IgM， 但IgM在血液中的含量會因清除作用而迅速下降。因此羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白IgM質量濃度較斑節對蝦蛋白低，也證明其抗原性高于后者，應作進一步的檢測以確定其影響強度。

3　結 論

本實驗中羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白在SDS-PAGE圖中顯示由α鏈和β鏈構成。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫穩定后ICR小鼠產生的Ⅰ型膠原蛋白抗體質量濃度范圍為160.50～164.25 μg/L，不同劑量處理組間顯示出較小的差別，僅為2%，該結果也顯示出羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的低抗原性。用不同劑量的羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白免疫ICR小鼠后，IgG、IgA、IgM作為特征性免疫球蛋白，在各劑量處理組之間差異不大，其質量濃度范圍分別是424.81～437.59 ng/mL、46.86～49.53 μg/mL、1.81～1.89 ng/mL。IgG、IgA、IgM的檢測結果也顯示羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白的低抗原性。與Song等[16]的研究結果比較，羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白和水母膠原蛋 白同樣可以引起較弱的免疫反應，可知結果的有效性。羅非魚皮Ⅰ型膠原蛋白低抗原性的結論暗示羅非魚Ⅰ型膠原蛋白作為食品的安全性及其作為生物材料的可能性。

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Antigen Response Properties of Tilapia Skin Type I Collagen

ZHANG Jingyi1, WU Wenhui2, WANG Nanping3, HE Lan3, Elango JEEVITHAN1, BAO Bin1,*
(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Shanghai Engineering Research Center of Aquatic-Product Processing and Preservation, Shanghai 201306, China; 3. Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433, China)

Abstract:Objective: To investigate the antigenicity of type I collagen isolated from tilapia skin and evaluate its biocompatibility. Methods: The purity of tilapia skin collagen was confirmed by SDS-PAGE, and the antigenicity was evaluated by measuring the changes in serum IgG, IgA and IgM induced by tilapia skin type I collagen in ICR mouse model using ELISA. Results: The tilapia skin type I collagen was pure. The antibody concentrations of tilapia skin collagenimmunized mice were 160.50–164.25 μg/L, and the concentrations of IgG, IgA and IgM were 424.81–437.59 ng/mL, 46.86–49.53 μg/mL and 1.81–1.89 ng/mL, respectively. Conclusion: Tilapia skin type I collagen has weak antigenicity responsitivty and proved to have superior biocompatibility for biomedical applications.

Key words:collagen; immunization; enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA); antigenicity

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507015

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0079-05

*通信作者：包斌（1965—），女，副教授，碩士，研究方向為海洋天然產物化學。E-mail：bbao@shou.edu.cn

作者簡介：張靜怡（1988—），女，碩士研究生，研究方向為海洋藥物。E-mail：zhangjyj@163.com

基金項目：國家自然科學基金委員會主任基金項目（81341082）；國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2011AA09070109）

收稿日期：2014-05-06