傳統風吹肉加工過程中的微生物演替及優勢菌群分析

蔣云露，王 猛，常 偉，李明元，王 衛，馬 力，饒 瑜,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.通威集團三文魚研究所，四川 都江堰 611800；3.成都大學生物產業學院，四川 成都 610106）

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傳統風吹肉加工過程中的微生物演替及優勢菌群分析

蔣云露1，王 猛1，常 偉2，李明元1，王 衛3，馬 力1，饒 瑜1,*

（1.西華大學食品與生物工程學院，四川 成都 610039；2.通威集團三文魚研究所，四川 都江堰 611800；3.成都大學生物產業學院，四川 成都 610106）

摘 要：研究傳統風吹肉在整個生產過程的不同階段中微生物的種類、優勢菌群及其數量變化情況。選用7 種培養基對不同加工階段風吹肉樣品中的不同微生物進行分離純化，并對其進行16S或18S rDNA分子生物學鑒定，鑒定得到加工過程存在于樣品肉中的優勢微生物9 種，其中細菌7 種和真菌2 種。結果表明：在傳統風吹肉生產過程中，料泡引起 微生物大量死亡后，風吹肉樣品中的各類微生物總數在風吹前10 d持續上升，在中后期達到穩定。以乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）為主的乳酸菌是川味風吹肉風吹過程中的主要優勢菌群，其次是以巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）為主的葡萄球菌，漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）次之。此外，芽孢桿菌（Bacillus spp.）和水生拉恩菌（Rahnella aquatilis）為川味風吹肉制作過程中的主要腐敗菌，但隨著風吹過程顯著減少。

關鍵詞：風吹肉；菌群動態變化；優勢微生物；16S rDNA；18S rDNA

風吹肉制品，是人們世代相傳發展起來的傳統肉類制品，具有加工簡易、風味獨特、便于貯藏等特點，深受廣大消費者的喜愛。風吹肉香味濃郁、色澤金黃或紅棕、咸鮮適口，是我國南方冬季長期貯藏的腌肉制品。而其作為一種傳統手工制作的肉制品，必須對其工藝進行改良才能適應現代工業化生產的需要。開展風吹肉中微生物種類、數量的動態變化研究是改進傳統加工工藝、控制產品質量、推動傳統手工加工向現代化生產轉變的客觀需要[1]。

風吹肉制品制作過程中，微生物發酵是影響風吹肉制品成熟度、口感風味的重要環節。發酵不成熟的產品在貯藏過程中極易發生腐敗變質，不僅造成經濟損失，滋生的一些腐敗微生物更是會對消費者的健康構成威脅。目前，對傳統腌臘肉制品的微生物特性、風味形成機理、風味調控技術、風味成分等問題的研究成果表明，火腿、發酵香腸等中等水分含量的傳統腌臘肉制品中的常見微生物有乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、霉菌、酵母等[2-3]。本研究采用分子生物學方法，對風吹肉不同發酵時期的微生物進行分離鑒定，了解產品在發酵過程中微生物的動態變化，為推動傳統風吹肉制品加工的轉型提供基礎數據。

1　材料與方法

1.1材料、培養基與試劑

四川省雅安市某公司提供傳統風吹肉生產工藝中不同階段的肉樣，包括：a.新鮮原料肉；b.料泡1 d后的肉；c.料泡1 d風吹2 d后的肉；d.風吹10 d的肉；e.風吹20 d的肉；f.風吹30 d的成品肉。

MRS 瓊脂培養基、M17瓊脂培養基、PCA培養基、虎紅瓊脂培養基、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）培養基、強化梭菌瓊脂培養基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養基、麥芽汁培養基 北京奧博興生物科技有限公司。

DNA Marker、Taq DNA連接酶、dNTP、基因組提取試劑盒、基因組純化試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；RNase A 美國Sigma公司。

1.2儀器與設備

臺式冷凍離心機 美國Beckman公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司；電泳儀 北京六一儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠。

1.3方法

1.3.1菌株分離

用無菌剪刀剪取a～f樣品各10 g，分別與90 mL無菌生理鹽水混合，超聲波振蕩30 min。分別吸取100 μL的混合液涂布到MRS、M17、PCA、虎紅、VRBA、強化梭菌及甘露醇氯化鈉固體培養基上。涂布好后至于相應溫度（MRS、M17、PCA、VRBA、強化梭菌培養基于37 ℃，虎紅瓊脂于30 ℃，甘露醇氯化鈉瓊脂于35 ℃）培養箱中培養24～48 h，參照GB 4789.15—2010《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》對菌落進行計數，并記錄菌落形態。

1.3.2 菌株的鑒定

對不同形態的菌落進行計數并挑取接種于相應液體培養基中，相應溫度下搖床培養24～48 h，得到濃度約106CFU/mL的菌液。采用相應基因組提取試劑盒，對各菌株培養液進行總基因組的提取，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗結果。細菌樣品以各基因組為模版，以Eu27F和1490R為引物，擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 個循環；72 ℃ 10 min，進行16S rDNA片段的擴增。真菌樣品以NS1和NS4 為18S rDNA擴增引物，擴增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30 個循環；72 ℃10 min，進行18S rDNA片段的擴增。擴增產物經膠回收純化后送上海華津生物科技有限公司進行測序，有關引物序列見表1。

表1　16S rDNA、18S rDNA PCR擴增引物序列表Table 1 Primers uused for PCR amplification of 16S rDNA and 18S rDNA

測序序列于NCBI GenBank Database中進行BLAST比對，并使用MEGA 5.0構建系統發育樹。

2　結果與分析

2.1風吹肉加工過程中微生物總數的變化

有研究發現，四川臘肉、自然風干發酵香腸以及培根火腿中的微生物種類主要有：酵母菌、乳酸菌、葡萄球菌、產氣莢膜梭菌以及腸桿菌等[4-6]。因此本實驗選擇了相應培養基對其進行分離篩選。選擇MRS與M17培養基用于乳酸菌的分離篩選，虎紅培養基用于真菌類的分離篩選，VRBA培養基用于腸道菌群微生物的分離篩選，強化梭菌培養基用于分離篩選梭菌類，甘露醇氯化鈉培養基用于分離篩選葡萄球菌。

圖1　風吹肉生產過程中微生物總數變化Fig.1 Microbial amounts in meat samples during air-drying process

由圖1可知，新鮮肉中的微生物總數為5.16（lg（CFU/g）），在料泡結束時微生物總數急劇減少到最低值。風吹肉醬料的鹽含量一般為8%～10%，在鮮肉料泡過程中，醬料的高鹽濃度形成高滲環境，造成微生物脫水死亡，泡料后微生物總數降為4.72（lg（CFU/g））。陳美春等[4]也報道在四川臘肉生產過程中，腌制會使鮮肉中的微生物數量降低1～2 個數量級。產品料泡結束后立即將樣品放在室外風吹，料泡過程中存活的微生物及外界環境中附著到肉上的微生物開始大量繁殖，微生物總數量隨著風吹時間延長而逐漸增加。在風吹初期（前10 d），微生物數量增長較快，達到5.08 （lg（CFU/g））；風吹10～20 d，微生物數量相對平穩；風吹后期（20～30 d），微生物數量有所下降，為4.93 （lg（CFU/g））。

2.2風吹肉生產過程中不同培養基上的微生物數量

圖2　風吹肉生產過程中不同培養基上的微生物總數Fig.2 Microbial amounts in different media during air-drying process

由圖2A可知，MRS、M17培養基中的微生物總數即乳酸菌數變化趨勢類似。在料泡過程中，2 種培養基上的乳酸菌數從最初的4.10、4.72 （lg（CFU/g））分別降至3.58、4.48 （lg（CFU/g））。風吹前2 d，微生物總數保持一個較穩定的狀態，在風吹2～10 d時出現了上漲的趨勢，在第10天分別達到：4.10 （lg（CFU/g））（MRS）、4.91 （lg（CFU/g））（M17）。乳酸菌數逐漸增多成為優勢菌群，同時分泌大量乳酸等代謝產物，改變產品風味口感的同時也會一定程度上抑制其他微生物的生長，乳酸菌對食品的保護作用主要是由于一些活性代謝產物的生成，比如有機酸（乳酸、醋酸、甲酸、丙酸、丁酸等），可通過降低體系的pH值來抑制其他微生物生長[7]。風吹中期（風吹10～20 d），兩種平板上的乳酸菌數量均保持基本穩定的狀態，而在風吹后期（風吹20～30 d），這兩種平板上的微生物數量均呈現下降趨勢，分別從4.11 （lg（CFU/g））（MRS）和4.90 （lg（CFU/g））（M17）下降至3.90 （lg（CFU/g））（MRS）和4.78 （lg（CFU/g））（M17）。

由圖2B可知，虎紅培養基、VRBA培養基、強化梭菌培養基這3 種培養基中的微生物總數在料泡及風吹前期的變化趨勢類似。由于料泡時使用的醬料含鹽量高，高滲環境會使微生物細胞大量脫水死亡，因此虎紅培養基和VRBA培養基上的微生物總數分別從最初的4.30、4.78 （lg（CFU/g））迅速降至3.86、3.73 （lg（CFU/g））。料泡結束到風吹2 d之間，微生物重新開始大量繁殖，微生物總數呈現上升趨勢，3 種培養基上的細菌均增加為4.36 （lg（CFU/g））（虎紅）、4.29 （lg（CFU/g））（VRBA）；4.13（lg（CFU/g））（強化梭菌）。一段時間后其生長所需某些營養成分消耗殆盡，加之受到乳酸菌等優勢菌種所產生的抑制作用，其數量開始逐漸下降，分別降至4.08 （lg（CFU/g））（虎紅）、0 （lg（CFU/g））（VRBA）、3.66 （lg（CFU/g））（強化梭菌）。在風吹后期（風吹20～30 d）這3 種培養基上的細菌或真菌數量均基本保持穩定。

由圖2C可知，甘露醇氯化鈉培養基中的微生物總數變化情況較為特殊，這是因為一些葡萄球菌能夠耐受高濃度的鹽含量。因此在料泡過程中，其他菌群的生長均受到抑制，而葡萄球菌被抑制程度則較弱。葡萄球菌在腌制過程中的變化趨勢與陳美春等[4]的結論一致。在醬料腌制過程中，葡萄球菌的數量呈現一個上升的趨勢，逐步增加達到3.62 （lg（CFU/g））。風吹前2 d，由于真菌、腸道菌、梭菌的增加，形成了種間競爭，從而破壞了葡萄球菌的生長趨勢，使葡萄球菌的數量呈現下降狀態。在之后的風吹初期，真菌、腸道菌、梭菌的數量逐漸減少，種間競爭也逐漸減弱，這使得葡萄球菌的數量再一次出現增長趨勢，達到4.04 （lg（CFU/g）），趙俊仁等[5]在自然發酵風干腸發酵3～6 d時，也曾發現葡萄球菌出現增長的情況。在風吹10～30 d的過程中，葡萄球菌的數量呈連續緩慢下降狀態，最終達到3.90 （lg（CFU/g））。

2.3優勢菌株的分離與菌落形態

篩選出在風吹肉加工過程中一直存在或者在某些階段數量較多的菌種，對其進行更進一步的分離鑒定，挑選菌株形態如表2所示。

表2　挑取菌株的菌落形態Table 2 Colony morphology of selected strains

在各種培養基上各挑取1～2 個典型單菌落來進行鑒定。其中，真菌在前期用虎紅培養基進行分離，后期點種到麥芽汁培養基上進行形態觀察。M17培養基上挑取菌株F1，PCA培養基上挑取菌株F2、F3，強化梭菌培養基上挑取菌株F4、F5、F6，VRBA培養基上挑取菌株F7、F8，甘露醇氯化鈉培養基上挑取菌株F9、F10、F11，麥芽汁培養基上挑取菌株F12、F13。

2.4生產過程中優勢菌株的鑒定

圖3　細菌（A）和真菌（B、C）總基因組電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of genome DNA of bacteria (A) and fungi (B, C)

由圖3可知，對細菌及真菌總基因組進行電泳，條帶清晰，與Marker進行比較后可以發現，樣品條帶處于15 000 bp以上，因此可以確定總基因組提取成功。圖4A、4B分別表示16S rDNA PCR及18S rDNA PCR擴增電泳圖，可以看出樣品條帶均處于1 000～2 000 bp之間。16S rDNA擴增片段約為1 540 bp，18S rDNA擴增片段約為1 800 bp，因此可以確定16S rDNA PCR及18S rDNA PCR擴增成功。

圖4　16S rDNA（A）和18S rDNA（B）PCR擴增電泳圖Fig.4 Gel electrophoresis of PCR-amplified products of 16S rDNA (A) and 18S rDNA (B)

圖5　細菌（A）和真菌（B）系統發育樹Fig.5 Phylogenetic trees of bacteria (A) and fungus (B)

菌株測序結果經BLAST比對后構建系統發育樹如圖5所示。分析可知F2、F7及F11菌為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），F8菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），F10菌為克氏葡萄球菌（Staphylococcus kloosii），F3菌為腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus），F9菌為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri），F1菌為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），F4、F5及F6菌均為水生拉恩菌（Rahnella aquatilis），F12菌為漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii），F13為解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）。這些微生物在風吹肉制作過程中的數量變化如圖6所示。

圖6　不同微生物在風吹肉生產過程中的數量變化Fig.6 Microbial amounts in different cultures of meat samples during air-drying process

作為許多食品自然發酵過程中的優勢菌群，乳酸菌被認為是安全的[8]，同時其作為發酵劑也在制作發酵蔬菜、乳制品和肉制品等食品的過程中發揮著重要的作用[9-10]。由圖6A可知，在整個風吹肉加工過程中，乳酸乳球菌基本處于優勢地位。在料泡階段，乳酸乳球菌受到高濃度鹽的影響，數量迅速下降50%；在風吹初期（前10 d），乳酸乳球菌總體呈現一個先下降后上升的趨勢，乳酸乳球菌適應新的環境開始重新生長繁殖，達到4.73（lg（CFU/g））。在風吹中期及后期（風吹10～30 d），乳酸乳球菌的數量在基本維持恒定的情況下稍有下降，最終降至4.72 （lg（CFU/g））。乳酸菌的數量變化情況與趙俊仁等[5]在風吹發酵腸過程中得出的結果類似，其研究得出，在自然風吹發酵腸的生產過程中，乳酸菌在風吹前3 d呈現上升趨勢，而在之后的3～10 d則出現下降的趨勢。

圖6B為3 種葡萄球菌——巴氏葡萄球菌、克氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌在風吹肉生產過程中的數量變化情況。其中最主要的是巴氏葡萄球菌，克氏葡萄球菌次之，腐生葡萄球菌數最少。在料泡過程中，巴氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌數量急劇下降，而克氏葡萄球菌則增加至3.43 （lg（CFU/g））。這可能是因為克氏葡萄球菌對鹽濃度的耐受能力較高，也可能是因為醬料中本身就帶有這種菌體，從而引入到了肉制品中。在風吹前2 d，巴氏葡萄球菌數量迅速回升，從3.08 （lg（CFU/g））增加至4.13 （lg（CFU/g）），在風吹2～10 d的過程中開始下降，降到3.65 （lg（CFU/g）），而克氏葡萄球菌此期間逐漸成為優勢葡萄球菌，并維持在4 （lg（CFU/g））。Kung等[11]曾在金槍魚臘腸中分離得到巴氏葡萄球菌，Bermúdez等[12]也曾從傳統香腸中分離得到了巴氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌。

圖6C為漢遜德巴利酵母和解脂耶氏酵母在風吹肉的加工過程中的變化情況。在料泡過程中，解脂耶氏酵母由于受到醬料高鹽濃度的影響，數量開始下降，減少量達到2.90 （lg（CFU/g））。而漢遜德巴利酵母變化狀況則與之相反，在風吹前兩天呈現一定的上升趨勢，這可能是由醬料引入的，同時漢遜德巴利酵母的耐鹽性較高，而解脂耶氏酵母受鹽濃度的影響相對更敏感[13]。而在之后的風吹過程中（2～30 d），漢遜德巴利酵母的數量則總體趨于減少的情況。從風吹2 d時的3.91 （lg（CFU/g））減少至最終的3.48 （lg（CFU/g））。解脂耶氏酵母的數量在風吹前20 d緩慢增加（從2.90（lg（CFU/g））增加至3.20 （lg（CFU/g））），在風吹后10 d又緩慢下降（從3.20 （lg（CFU/g））降至3.08（lg（CFU/g））），在整個風吹過程中，解脂耶氏酵母的數量基本保持恒定的狀態。這與秦丹等[14]在四川香腸加工貯藏過程中所發現的酵母變化情況類似，在加工貯藏后期，酵母數量基本不改變。

圖6D顯示的是短小芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌以及水生拉恩菌在風吹肉生產過程中的數量變化情況。有報道稱，芽孢桿菌會在一定條件下引起軟包裝肉的變質[15]。料泡階段使短小芽孢桿菌和水生拉恩菌急劇減少，但短小芽孢桿菌在風吹前2 d數量有所上升，風吹中后期其數量回落至2.78 （lg（CFU/g））。因此，芽孢桿菌是風吹肉加工過程中需要防控的主要腐敗微生物。已有文獻報道在腌臘肉制品加工過程中腐敗或病原微生物數量有所下降的情況[16-17]，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌等病原菌在臘肉、培根等的加工或貯藏過程中有顯著減少的現象。

3　討 論

在肉品腌制過程中，由于微生物代謝活動降低了pH值，使肉品得以保存同時改變了原料的質地、氣味、顏色和成分，并賦予產品良好的風味[4]。有報道稱，乳酸菌是最早從發酵肉制品中分離出來的微生物，是發酵肉制品中的優勢菌種。乳酸菌可以利用碳水化合物產生乳酸而使pH值降低，產酸率高，耐酸性較強。乳酸菌可抑制一些致腐微生物生長、減少腐敗、穩定產品的質量并提高產品的貨架期，改善肉制品的組織結構，促進發色，降低亞硝酸鹽殘留量[18]。微生物代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，與含硫化合物反應，可產生類似培根的風味；其中葡萄球菌可代謝亮氨酸生成3-甲基丁醛，3-甲基丁醛對人類的感覺閾值很低，對發酵肉制品的典型風味有重要影響，可作為產香性能的量化指標[19]。酵母菌有時可以促進發酵后肉制品的風味形成，還可以對腌臘肉制品本身的紅色起到一定的穩定作用[13]。此外，酵母還可提高發酵肉制品中氨含量，并降低其中的乙酸和乳酸含量[20]。

本實驗結果表明，在料泡過程中除了由醬料引入或對鹽濃度有較高耐受性的克氏葡萄球菌、漢遜德巴利酵母以及枯草芽孢桿菌外，其他菌株的生長均受到較大的抑制。經過料泡后，微生物重新開始大量繁殖，乳酸乳球菌是最主要的優勢菌種，其次是葡萄球菌（尤其以巴氏葡萄球菌占主導），酵母菌（漢遜德巴利酵母和解脂耶氏酵母）次之。乳酸菌在改變產品風味的同時，一定程度上抑制了其他微生物的生長。雖然在風吹肉制作前期有一定數量的腐敗菌芽孢桿菌和條件致病菌水生拉恩菌，隨著料泡和風吹過程的進行卻逐漸降低，但仍然需要在今后的加工過程中引起重視，加強生產過程中各個關鍵控制點的管理，采取相應手段控制腐敗微生物的生長，避免對消費者的身體健康造成傷害。

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Microbial Community Succession and Dominant Microbial Population during the Processing Stages of Traditional Air-Dried Meat

JIANG Yunlu1, WANG Meng1, CHANG Wei2, LI Mingyuan1, WANG Wei3, MA Li1, RAO Yu1,*
(1. School of Food and Biotechnology, Xihua University, Chengdu 610039, China; 2. Institute of Salmon, Tongwei Group Co. Ltd., Dujiangyan 611800, China; 3. Faculty of Biological Industry, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

Abstract:The microbial population, diversity and dynamics of traditional air-drying meat during different processing stages were assessed. Seven culture media were used to separate different microorganisms from different air-drying meat samples. Nine species were selected as dominant microorganisms including seven species of bacteria and two species of fungi. 16S rDNA or 18S rDNA analysis was employed for species identifi cation. The results showed that following the microbial growth inhibition during the salted process, the population of different microbial communities in meat samples increased gradually during the fi rst 10 days and reached a stable level at the later stages of air-drying processing. Lactic acid bacteria based on Lactococcus lactis dominated the air-drying process, followed by Staphylococcus pasteuri, Debaryomyces hansenii and Yarrowia lipolytica. Furthermore, Bacillus spp. and Rahnella aquatilis were the major spoilage bacteria, but their amounts decreased signifi cantly during the air-drying processing. This study can provide a useful guidance for starter culture screening and safety control of traditional air-drying meat.

Key words:air-dried meat; microbial dynamics; dominant microorganisms; 16S rDNA; 18S rDNA

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507021

中圖分類號：TS251.5

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0111-06

*通信作者：饒瑜（1982—），女，副教授，博士，研究方向為食品微生物。E-mail：ryfish@163.com

作者簡介：蔣云露（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品工程。E-mail：jiangyl0104@hotmail.com

基金項目：肉類加工四川省重點實驗室開放基金項目（13-R09）；西華大學“西華杯”大學生科技創新項目（2014136）；西華大學研究生創新基金項目（ycjj2014142）

收稿日期：2014-06-30