缺失ATP合酶和插入VHb基因對鈍齒棒桿菌谷氨酸產量的影響

鄭方亮，于 亮，牟曉叢，劉 鵬，劉宏生*

（遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036）

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缺失ATP合酶和插入VHb基因對鈍齒棒桿菌谷氨酸產量的影響

鄭方亮，于 亮，牟曉叢，劉 鵬，劉宏生*

（遼寧大學生命科學院，遼寧 沈陽 110036）

摘 要：為了提高鈍齒棒桿菌生產谷氨酸的產量，以谷氨酸生產菌鈍齒棒桿菌（Corynebacterium crenatum）T6-13為出發菌株，利用同源重組技術使其缺失ATP合酶基因（atp）并進一步插入透明顫菌血紅蛋白基因（VHb），得到兩株重組菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb，通過檢測重組菌株谷氨酸產量及生長情況可以看出，在發酵32 h后，atp基因缺失菌株較出發菌株谷氨酸產出累積量高27.76%，但atp基因缺失導致菌體生長緩慢且無法到達出發菌株穩定期濃度，而插入VHb基因的atp基因缺失菌株的谷氨酸產出累積量較出發菌株高36.91%，且菌體的生長速率及穩定期濃度與出發菌株基本一致。

關鍵詞：鈍齒棒桿菌；谷氨酸；ATP合酶；透明顫菌血紅蛋白

谷氨酸是構成蛋白質的20 種常見氨基酸之一，在食品、醫藥、工業、農業等領域都有廣泛應用，是世界上銷量最大的一種重要氨基酸[1]。谷氨酸具有增香作用，可使食品味道更加濃郁、協調、圓潤[2]。谷氨酸是中樞神經系統主要的興奮性神經遞質，在腦缺血造成的神經元損傷過程中發揮重要作用，其傳導異常會導致精神分裂、認知障礙、運動障礙等[3-4]。在谷氨酸的工業生產中，影響其成本的關鍵因素是谷氨酸生產菌的生產效率。如今，關于谷氨酸發酵生產的研究主要致力于節能降耗、降低成本、改善生產及生態環境等幾個方面[5]；在日用品化妝品領域中，谷氨酸作為富脂劑或乳化助劑配入膏劑、漂洗劑等乳化制品中[6]，而且谷氨酸及其制劑是優良的植物生長調節劑，主要用于促進禾本科植物及闊葉植物的生長[7]；氨基酸銅絡合物可用作殺菌劑[8]。

現代分子生物學技術的發展以及谷氨酸棒桿菌全基因組測序的完成，為構建優良的生產用谷氨酸高產菌株提供了可能。ATP合酶在生物體內用于ATP的合成，由atp基因編碼，若atp基因缺失，將會阻斷氧化磷酸化作用，從而導致碳和能量代謝的改變[9-10]。近年的研究表明糖酵解（glycolysis）途徑中ATP合酶基因的缺失，可加速糖酵解速率，增大進入三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環的碳流量，顯著提高谷氨酸產量[11-12]。同時，研究發現ATP合酶的缺失雖然促進了細菌呼吸速率的增加及呼吸相關基因的表達，但菌體的生長速率有所下降[13]。

透明顫藻細菌血紅蛋白（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）是在透明顫菌中發現的[14]。透明顫菌是Tyree等[15]在20世紀70年代發現的一種專性好氧的革蘭氏陰性絲狀菌，能夠在沼澤、腐爛植物等貧氧的環境中生長旺盛，并發現這種特性是由于該菌在貧氧的條件下能夠產生一種可溶性血紅蛋白，進一步的研究表明這種血紅蛋白與真核生物血紅蛋白具有高度的同源性和相似的生理功能。VHb是一種同源雙亞基蛋白，每個亞基的相對分子質量為15 775，分別含有146 個氨基酸以及兩個b型血紅素輔基，其血紅素上的亞鐵原子能夠與氧可逆性結合[16]。隨著VHb基因的成功克隆，國內外對其功能的研究越來越深入，目前VHb基因已經在多種微生物和植物中得到了廣泛的研究，大量實驗結果表明VHb可降低宿主細胞對溶氧的敏感程度，提高細胞的呼吸強度，通過提高發酵過程中菌體的攝氧率，加快細胞的生長速率，增加其代謝產物產量[17-18]。Liu Qian等[19]將VHb基因導入谷氨酸棒桿菌中明顯提高了谷氨酰胺和谷氨酸的產量，但由于VHb基因是由質粒攜帶，可能存在質粒不穩定現象，大大限制了工程菌的應用。

現在生產上使用的菌株大多采用傳統誘變育種方法篩選得到，但該法存在盲目性高、工作量大、突變株生理失調、易 退化等局限性。因此，采用代謝工程育種方法有目的地、精確地改造菌種就成為該項研究的主要方向。本研究擬從調控谷氨酸代謝途徑的角度出發，在基因組水平上對谷氨酸生產菌鈍齒棒桿菌T6-13進行改造，通過缺失atp基因和插入VHb基因，研究兩基因協同效應對谷氨酸生產量的影響，并研究基因改造對細菌生長代謝造成的影響，從而為構建高產谷氨酸的生產菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株及質粒

鈍齒棒桿菌T6-13 中國工業微生物菌種保藏管理中心；大腸桿菌JM109、DH5α、質粒pMD19-T Simple 寶生物工程（大連）有限公司；質粒pK19mobsacB 德國Kalinowski教授惠贈；pK19mobsacB-ΔodhA-VHb 遼寧大學生命科學院動物資源與疫病防治實驗室前期構建。

1.1.2 酶及試劑

Ex Taq酶、限制性內切酶、細菌基因組小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA純化試劑盒、Clontech抑制性削弱雜交PCR試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；胰蛋白胨、酵母提取物 英國Oxoid公司；谷氨酸（色譜純） 奧博星生物技術責任有限公司；異硫氰酸苯酯（分析純）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）、三乙胺（分析純）、正己烷（分析純） 山東禹王實業有限公司化工分公司。

1.1.3 培養基

鈍齒棒桿菌電轉感受態細胞培養基為（1 L）：蛋白胨10 g、酵母粉5 g、氯化鈉10 g、甘氨酸30 g、吐溫-80 1 mL；發酵培養基為（1 L）：葡萄糖140 g、氯化銨40 g、生物素2 μg、水合硫酸鋅0.01 g、水合硫酸鎂0.05 g、磷酸氫二鉀0.5 g、硫酸錳0.02 g、VB10.001 g、碳酸鈣50 g（干熱滅菌）、尿素8 g（0.45 μm濾膜過濾除菌），用KOH調節pH 7.0～7.2。固體培養基添加1.2 g/100 mL瓊脂，使用前將培養基融化并冷卻至55 ℃左右加入抗生素。培養大腸桿菌時添加卡那霉素至終質量濃度50 μg/mL，培養鈍齒棒桿菌時添加卡那霉素至終質量濃度為25 μg/mL。

1.2儀器與設備

MicroPulserTM電轉儀、Universal HoodⅡ紫外凝膠電泳成像儀、AB 9902 PCR儀 美國Bio-Rad公司；HC-2518R冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司；DYY-2凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；UV-2700紫外分光光度計 上海天河環境技術有限公司；Waters 1525 Binary HPLC液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器和Breeze 2色譜操作系統） 美國Waters公司。

1.3方法

1.3.1 引物設計與合成

表1　引物列表Table 1 List of primers used in this study

設計引物F1、R1用于擴增atp基因上游同源臂，引物F2、R2用于擴增atp基因下游同源臂，并在R1和F2的5’端引入SphⅠ和SmaⅠ酶切位點；設計引物F3、R3用于擴增tac啟動子，F3的5’端引入SphⅠ酶切位點；設計引物F4、R4用于擴增VHb基因，F4的5’端引入一段tac啟動子3’端序列；R4的5’端引入T7終止子的上半部分序列；設計引物R5用于引入T7終止子，R5的3’端為R4的重疊序列，5’端引入T7終止子的下半部分序列以及SmaⅠ酶切位點；設計引物F6，R6用于篩選缺失atp基因重組菌株。引物序列列于表1（陰影部分分別為SphⅠ和SmaⅠ酶切位點，下劃線部分為T7終止子序列）。

1.3.2重組質粒pK19mobsacB-Δatp的構建

以鈍齒棒桿菌T6-13基因組DNA為模板，用引物F1/R1和F2/R2分別聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增ATP合酶基因上游同源臂atpF和下游同源臂atpR。PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；98 ℃變性10 s，68 ℃退火、延伸1.5 min，30 個循環；4 ℃終止反應，回收產物。使用Clontech In-FusionTMAdvantage PCR Cloning Kit將atpF和atpR與經EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切的線性質粒pK19mobsacB進行In-Fusion連接，得到重組質粒pK19mobsacB-Δatp。

1.3.3重組質粒pK19mobsacB-Δatp-tac-VHb的構建

分別以質粒pGEX-KG和質粒pK19mobsacB-ΔodhAVHb為模板，F3/R3和F4/R4為引物，PCR擴增tac啟動子和VHb基因。PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。回收產物tac啟動子和VHb基因。以回收得到的tac啟動子和VHb基因片段為模板，F3/R5為引物，進行2 次PCR擴增，以拼接tac啟動子、VHb基因和T7終止子，得到基因片段tac-VHb。PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。回收目的條帶tac-VHb片段后進行加“A”反應，經純化后與pMD19-T Simple載體連接得到重組質粒pMD19-Tsimple-tac-VHb。

用SphⅠ/SmaⅠ對重組質粒pMD19-T simple-tac-VHb 和pK19mobsacB-Δatp分別進行雙酶切。回收tac-VHb小片段以及pK19mobsacB-Δatp線性DNA片段，用連接酶進行連接得重組質粒pK19mobsacB-Δatp-tac-VHb。

1.3.4重組菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb的構建及鑒定

挑取新鮮的鈍齒棒桿菌T6-13單菌落于LB液體培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養12 h，按2%的接種量接種于100 mL鈍齒棒桿菌電轉感受態細胞培養基中，30 ℃、200 r/min振蕩培養5～7 h，至細胞OD600 nm值達約0.6。冰浴20 min后，轉移至預冷的50 mL離心管中，4 ℃、4 000 r/min離心5 min棄上清液，用預冷的10%甘油于冰上重懸菌體洗滌3 次，最后用預冷的10%甘油重懸細胞（每50 mL原液用200 μL甘油重懸），每管80 μL分裝于1.5 mL Eppendorf管中，－80 ℃保存待用。轉化時冰浴融化，加入2 μL質粒混勻，轉移至預冷的1.0 mm電擊杯中，于1.8 kV、4 ms條件下電擊，電擊后立即加入含0.5 g/10 0 mL葡萄糖的液體LB培養基1 mL，混勻并轉移至1.5 mL Eppendorf管中，46 ℃熱激6 min，然后30 ℃、200 r/min振蕩培養1 h，離心濃縮菌體后涂布于含有25 μg/mL卡那霉素的LB平板上，30 ℃培養36～48 h。

菌落PCR篩選陽性轉化子，確定自殺載體是否通過同源重組插入到鈍齒棒桿菌基因組中。用F6、R6引物PCR鑒定atp基因的缺失，PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，30 個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應；用F1、R2引物PCR鑒定VHb的插入。PCR反應條件為：98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環后，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應。

1.3.5 CO差光譜法檢測VHb活性

因為VHb可與CO形成VHb-CO復合物，該復合物在419、535、566 nm波長處呈現特征吸收峰，因此實驗通過CO差光譜法檢測VHb蛋白的表達。細菌培養至對數期后離心集菌，玻璃珠振蕩破碎處理后，－20 ℃凍融處理4 次，加磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）重懸，靜置2 min后棄去沉淀，剩余的菌懸液中加入過量的Na2S2O4，樣品端和參比端分別鼓入CO氣體和空氣3 min，在紫外分光光度計上檢測410～500 nm波長范圍內的吸光度，計算樣品端和參比端差值[20]。對照組樣品測定方法同上。

1.3.6重組菌株生長曲線的測定

分別挑取T6-13、T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb單菌落于200 mL新鮮的LB液體培養基中，振蕩培養過夜。按1%的接種量接種于LB液體培養基中，于180 r/min轉速條件下連續培養24 h，每隔2 h取樣測定培養物的OD600 nm值，實驗數據為3 次重復實驗的平均值。以時間（h）為橫坐標，OD600 nm值為縱坐標繪制細菌生長曲線。

1.3.7谷氨酸產量的測定

谷氨酸標準曲線的繪制：分別配制質量濃度為0、100、200、500、1 000 μg/mL的谷氨酸標準品溶液，苯異硫氰酸酯（phenyl isothiocyanate，PITC）法柱前衍生后，進行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析檢測。繪制谷氨酸峰面積與對應質量濃度關系曲線。

分別挑取T6-13、T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb單菌落于10 mL LB液體培養基中，搖瓶培養至對數期，按1%接種量分別接種于200 mL的發酵培養基中，30 ℃、180 r/min培養48 h。從20 h起每隔4 h取樣一次，取樣時間分別為20、24、28、32、36、40、44、 48 h。所取樣品離心收集上清液，取500 μL進行柱前衍生反應，處理后取20 μL進樣，按色譜條件：色譜柱：Waters XBridge C18（4.6 mm×500 mm，5 μm）；柱溫：38 ℃；檢測波長：254 nm；流動相：流動相A（0.1 mol/L醋酸鈉溶液）和流動相B（乙腈），0.45 μm濾膜過濾、超聲波脫氣0.5 h后使用，按體積比97∶3進樣。流動相流速：1 mL/min進行HPLC檢測，根據標準品工作曲線計算相應的谷氨酸產量[21-22]。

1.3.8重組菌株谷氨酸產量差異顯著性分析

對培養32 h的3 個菌株產谷氨酸量進行比較，每個實驗重復3 次，結果以±s表示。數據結果采用SPSS 12.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1重組質粒pK19mobsacB-Δatp的構建

構建重組載體pK19mobsacB-Δatp，分別用SmaⅠ和SphⅠ酶切鑒定重組質粒pK19mobsacB-Δatp，見圖1。對atpF和atpR基因片段測序后進行BLAST比對，結果表明從鈍齒棒桿菌T6-13中克隆的atpF和atpR片段與GenBank中登記的ATP合酶基因序列完全相同。

圖1　重組質粒pK19mobsacB-Δaattpp的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pK19mobsacB-Δatp by restriction enzyme digestion

2.2重組質粒pK19mobsacB-Δatp-tac-VHb的構建

圖2　重組質粒pK19mobsacB-Δaattpp-ttaacc-VVHHbb的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pK19mobsacB-Δatp-tac-VHb by restriction enzyme digestion

PCR得到基因片段tac-VHb，將回收得到的拼接片段tac-VHb連接到T載體上后進行測序，進行BLAST比對分析，結果表明tac啟動子和VHb片段與GenBank中登記的序列一致。將tac-VHb片段克隆到pK19mobsacB-Δatp，SmaⅠ/SphⅠ對其進行雙酶切鑒定，圖2結果表明片段大小與預期片段大小（大片段8 160 bp、小片段750 bp）一致。

2.3重組菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb的篩選及鑒定

將上述提取的質粒p K 1 9 m o b s a c B -Δ a t p和pK19mobsacB-Δatp-tac-VHb，電轉化到制備好的T6-13電轉感受態細胞中，得到轉化子單菌落，菌落PCR篩選陽性轉化子，結果見圖3和圖4，表明得到重組菌株T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb。

圖3　菌落PCR篩選T6-13-Δaattpp陽性轉化子Fig.3 Screening of T6-13-Δatp strain by bacterial colony PCR

圖4　菌落PCR篩選T6-13-Δaattpp-ttaacc-VVHHbb陽性轉化子Fig.4 Screening of T6-13-Δatp-tac-VHb strain by bacterial colony PCR

2.4CO差光譜法檢測VHb蛋白活性

圖5　VHb在T6-13-Δaattpp-ttaacc-VVHHbb中表達的CCOO差光譜Fig.5 CO difference spectrum of VHb expressed by T6-13-Δatp-tac-VHb

CO差光譜法檢測VHb蛋白活性結果見圖5。實驗結果表明重組菌株中的VHb基因成功表達且表達的VHb蛋白具有功能活性。

2.5Atp基因缺失及VHb基因插入對宿主菌生長的影響

圖6　出發菌株與重組菌株生長曲線Fig.6 Growth curve of recombinant bacteria

測定T6-13、T6-13-Δatp和T6-13-Δatp-tac-VHb這3 株菌株的生長速率曲線如圖6所示，atp基因缺失突變株達到穩定期后不能達到出發菌株的生長濃度。而插入了VHb基因的重組菌，其達到穩定期后的菌體濃度較缺失atp基因的突變株有明顯增加，基本接近于出發菌株。

2.6重組谷氨酸產生菌與出發菌株谷氨酸產量的比較

由圖7可知，谷氨酸的出峰時間為6.217 min，谷氨酸發酵液與谷氨酸標準品出峰時間相同，說明發酵液檢測到的確為發酵產物谷氨酸。由圖8可知，隨著發酵時間的延長，谷氨酸的積累量逐漸增多，在32 h時谷氨酸的積累量達到最大。并且atp基因缺失突變株和atp基因缺失且插入VHb基因的突變株的谷氨酸產生量明顯高于出發菌株。atp基因缺失突變株T6-13-Δatp的谷氨酸平均產生量為（45.523±0.197） g/L，而出發菌株T6-13的谷氨酸平均累積量為（35.635±0.505） g/L，T6-13-Δatp比T6-13提高了27.76%。插入VHb基因的atp基因缺失突變株T6-13-Δatp-tac-VHb的谷氨酸平均產生量為（48.783±0.132） g/L，比出發菌株提高了36.91%，比atp基因缺失突變株提高了7.16%。

圖8　出發菌株與重組菌株的谷氨酸產生動力學曲線Fig.8 Dynamic curves of glutamic acid production by recombinant bacteria

3　討 論

在谷氨酸的工業生產中，谷氨酸生產菌的生產效率是影響其成本的關鍵因素，為提高鈍齒棒桿菌發酵生產谷氨酸的生產效率，本研究通過基因工程手段對鈍齒棒桿菌進行了改造，以獲得更高產的谷氨酸生產菌。鑒于從代謝的角度分析，ATP合酶的缺失可提高谷氨酸的產量[12]，本研究通過同源重組使鈍齒棒桿菌ATP合酶基因缺失，從而使谷氨酸產量提高了27.76%，但ATP合酶基因的缺失嚴重影響了細菌自身的生長，導致生長速率減慢且無法達到出發菌株穩定期濃度。大量實驗結果表明，VHb可通過提高發酵過程中菌體的攝氧率，促進菌體生長，增加菌體代謝產物產量[23-26]。因此，本研究通過同源重組的方法向基因組中導入了VHb基因。實驗證明，該基因的引入不但使重組菌株穩定期濃度達到了出發菌株的水平，而且進一步提高了谷氨酸的產量，比原始菌株提升了36.91%。

通過缺失ATP合酶基因和引入VHb基因，有效地提高了鈍齒棒桿菌發酵生產谷氨酸的產量。由于涉及產權保護等原因，本實驗無法以高產的工業生產用菌株作為出發菌株，因此，雖然改造后的菌種比原始菌種的生產谷氨酸產量有了很大提高，但與目前工業生產谷氨酸菌種的產量還有一定差距，然而，此研究方法可以為其他工業發酵菌株的分子育種研究提供新思路，也為進一步構建更為穩定高產的工業用菌奠定了基礎。

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Effects of ATP Synthase Gene Deletion and VHb Gene Insertion on Production of Glutamic Acid in Corynebacterium crenatum

ZHENG Fangliang, YU Liang, MU Xiaocong, LIU Peng, LIU Hongsheng*
(Academy of Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

Abstract:In order to improve the yield of glutamic acid, we deleted the ATP synthase gene and inserted Vitreoscilla hemoglobin (VHb) gene into Corynebacterium crenatum genome by homologous recombination to acquire two recombinant Corynebacterium crenatum, T6-13-△atp and T6-13-△atp-tac-VHb. The yield of glutamic acid and growth of recombinant Corynebacterium crenatum were determined. The yield of glutamic acid produced by T6-13-△atp strain after 32 h of fermentation was 27.76% higher than that obtained from the original strain, although the recombinant strain grew more slowly and could not reach the concentration of the original strain at the stationary stage. Meanwhile, the yield of glutamic acid produced by T6-13-△atp-tac-VHb strain was 36.91% higher than that of the original strain during 32 h fermentation, and its growth rate and the glutamic acid concentration at the stable stage were the same as those observed for the original strain. These results may lay the foundation for constructing high-yield and stable industrial glutamic acid-producing strains.

Key words:Corynebacterium crenatum; glutamic acid; ATP synthase; Vitreoscilla hemoglobin

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507024

中圖分類號：Q939.97

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0131-06

*通信作者：劉宏生（1963—），男，教授，博士，研究方向為微生物學。E-mail：hongshengl@126.com

作者簡介：鄭方亮（1980—），男，副教授，博士，研究方向為微生物分子生物學。E-mail：flzheng1980@163.com

基金項目：遼寧省教育廳科學研究一般項目（2012008）

收稿日期：2014-05-13