根皮苷對雌性果蠅壽命的影響及其作用機制

趙 江，陳 純，韓曉東，劉素穩，馬 娜,4，王 浩,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津津酒集團，天津 300131；3.河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島　066600；4.天津科技大學生物工程學院，天津　300457）

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根皮苷對雌性果蠅壽命的影響及其作用機制

趙 江1，陳 純1，韓曉東2，劉素穩3，馬 娜1,4，王 浩1,*

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.天津津酒集團，天津 300131；
3.河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島066600；4.天津科技大學生物工程學院，天津300457）

摘 要：目的：研究根皮苷（phloridzin）對雌性果蠅壽命的影響并探究其延緩果蠅衰老的分子機制。方法：在果蠅壽命實驗中，采用2 日齡雌性果蠅作為研究對象，在其培養基中分別加入0、0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷進行培養，直至果蠅全部死亡， 計算果蠅的平均壽命和最長壽命； 通過白草枯和雙氧水急性實驗測定根皮苷對果蠅氧化應激損傷的影響；試劑盒法測定果蠅體內抗氧化酶活力；實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）檢測抗氧化基因表達水平。結果：2.0、5.0 mg/mL根皮苷可以顯著延長果蠅的平均壽命和最長壽命（P＜0.05）；根皮苷能夠對百草枯和雙氧水造成的雌性果蠅氧化應激損傷起到有效保護作用；添加 5.0 mg/mL根皮苷 可以極顯著提高Cu/Zn-超氧化物歧化酶（superoxide dism utase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力（P＜0.01），極顯著降低丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量（P＜0.01）；添加5.0 mg/mL根皮苷可以極顯著上調Cu/Zn-SOD及CAT mRNA表達水平（P＜0.01）。結論：根皮苷能夠延緩雌性果蠅衰老，且具有抗氧化作用，這可能與其調控抗氧化基因的表達水平相關。

關鍵詞：果蠅；根皮苷；壽命；抗氧化；酶活力；基因表達

根皮苷（phlorizin）屬于二氫查爾酮根皮素的糖苷衍生物[1-2]，在蘋果樹的根、皮、嫩葉以及多穗柯甜茶中含量比較豐富[3-4]。馮天艷等[5]研究發現根皮苷能顯著抑制由四氯化碳（CCl4）引起的小鼠自由基和脂質過氧化物的產生，顯著提高機體的抗氧化能力。Rezk等[6]研究發現根皮素能有效清除過氧亞硝基陰離子和抑制脂質過氧化。Vasantha Rupasinghe等[7]研究發現根皮苷的抗氧化活性強于VE，可以抑制多元不飽和脂肪酸的氧化。根皮苷具有抗氧化性，能夠顯著延長酵母菌的壽命，其在延緩衰老及研究抗衰老藥物方面引起了廣泛關注[8]。

果蠅（Drosoph ila melanogaster）具有與人類十分相似的衰老基因[9-10]，因此常被用作衰老生物模型。根皮苷具有多種生物活性，如調 節血壓、保護心臟、降血脂[11]、清除自由基[6-7]等，是藥用植物中主要活性成分之一，因而已廣泛運用于醫藥、化妝品、食品、植物組織培養等領域。然而，國內對于根皮苷抗氧化性的研究較少，其作用機理尚不明確。本實驗以雌性黑腹果蠅為模式生物，研究根皮苷對果蠅壽命、氧化應激損傷、體內抗氧化酶活力及丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量的影響，并從分子水平研究根皮苷對抗氧化相關基因超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）及methuselah（MTH，一種長壽基因）mRNA表達水平的影響。

1　材料與方法

1.1材料、動物與試劑

根皮苷（純度95%），由天津尖峰天然產物研究開發有限公司提供。

Oregon K野生型雌性黑腹果蠅，由天津科技大學食品添加劑與營養調控研究室提供。

分型SOD（Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、總SOD）試劑盒、CAT試劑盒、MDA試劑盒 南京建成生物工程研究所；Trizol試劑、cDNA合成試劑盒、SYBR Green日本TaKaRa公司。

1.2儀器與設備

UVmini-1240紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MyiQ2實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time polymerase chain reaction，real-time PCR）儀 美國Bio-Rad公司；HWS-850智能恒溫恒濕培養箱 寧波海曙賽福實驗儀器廠。

1.3方法

1.3.1 果蠅培養基的配制

基礎培養基：蒸餾水750 mL、玉米粉72 g、葡萄糖72 g、酵母粉10 g、瓊脂粉6 g、防腐劑（含質量分數為1%對羥基苯甲酸乙酯的75%乙醇溶液）40 mL，小火加熱并充分攪拌混勻至瓊脂完全溶化，停火后立即分裝到潔凈的果蠅培養試管中，培養基厚度約為1.0 cm。

給藥培養基：在基礎培養基中分別添加0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷。

1.3.2 果蠅壽命實驗

收集2 日齡Oregon K野生型雌性黑腹果蠅800 只，隨機分為4 組，每組10 管，每管20 只，培養在溫度（25±1）℃，相對濕度50%～60%的恒溫恒濕培養箱內。果蠅管內注入定量培養基，對照組果蠅飼喂基礎培養基，給藥組果蠅飼喂給藥培養基。保鮮膜封口培養果蠅，并留呼吸孔，每3 d更換一次新鮮培養基，同時觀察果蠅的生存狀況，記錄果蠅死亡數量，直至果蠅全部死亡。最后統計果蠅的平均壽命和最長壽命（每組最后存活的20 只果蠅的平均壽命）。

果蠅體質量的測定：收集40 日齡果蠅，禁食2 h后，CO2麻醉放于EP管中，每管20 只，稱質量，分別計算各組果蠅的平均體質量。

1.3.3 果蠅急性氧化應激損傷實驗

飼喂方法同壽命實驗，收集給藥25 日齡果蠅，禁食2 h，CO2麻醉導入干凈無培養基的果蠅培養試管內，用濾紙條沾少許含30% H2O2的6%葡萄糖水溶液插入果蠅管內，保證濾紙全部浸潤且不會有液滴流下，每2 h記錄果蠅死亡數，直至果蠅全部死亡，期間每隔4 h用注射器補給適量的H2O2液體保證濾紙條濕潤。同樣用20 mmol/L百草枯的6%葡萄糖水溶液替代濾紙條沾取的H2O2溶液，其余操作步驟相同，研究根皮苷對H2O2和百草枯所造成的果蠅急性氧化應激損傷的影響。

1.3.4 果蠅抗氧化酶活力和抗氧化基因表達水平的測定

果蠅培養同壽命實驗方法，收集40 日齡果蠅，禁食2 h后，CO2麻醉放于EP管中，每管20 只，稱質量，并進行平均體質量的計算，存放于－80 ℃進行后續酶活力和基因表達的測定。冰浴條件下，按照m（果蠅體質量）∶m（生理鹽水）＝1∶49注入生理鹽水并用玻璃勻漿器勻漿，4 ℃、2 500 r/min離心20 min，收集上清液測定SOD酶活力（黃嘌呤氧化酶法）、CAT酶活力（可見 光法）、蛋白質含量（考馬斯亮藍法）及MDA含量（硫代巴比妥酸法）。加入Trizol液氮研磨果蠅，離心得到RNA，并反轉錄得到cDNA。Real-time PCR法檢測抗氧化相關基因mRNA的表達水平，引物序列見表1。

表1　果蠅抗氧化基因PCR引物Table 1 PPCR primers for the detection of mRNA expression of antioxidant genes in Drosophila melanogaster

1.4數據處理

采用SPSS Statistics 17.0軟件進行分析，通過方差分析進行統計學顯著性檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。數據表示為±s。

2　結果與分析

2.1根皮苷對雌性果蠅壽命的影響

如表2和圖1所示，根皮苷對果蠅體質量無明顯影響，各組間差異不顯著（P＞0.05）。給藥組果蠅的平均壽命及最長壽命均高于對照組，且呈劑量依賴關系。其中5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅的平均壽命延長了16.3% （P＜0.05），最長壽命延長了12.4%（P＜0.01）。

表2　根皮苷對雌性果蠅體質量和壽命的影響（±s，n＝220000）Table 2 Effect of phlorizin on body weight and lifespan in female Drosophila melanogaster ((±s, n = 20000))

表2　根皮苷對雌性果蠅體質量和壽命的影響（±s，n＝220000）Table 2 Effect of phlorizin on body weight and lifespan in female Drosophila melanogaster ((±s, n = 20000))

注：*.與對照組相比，差異顯著（P＜0.05）；**.與對照組相比，差異極顯著（P＜0.01）。

根皮苷劑量/（mg/mL）　平均體質量/μg　平均壽命/d　最長壽命/d 0（對照組）　1 126.83±13.20　51.02±1.31　83.63±1.56 0.5　1 124.19±12.30　52.25±1.43　86.25±2.65 2.0　1 119.14±8.80　57.04±1.28*　92.34±1.05* 5.0　1 119.79±6.20　59.36±1.49*　94.00±1.64**

圖1　雌性果蠅壽命曲線Fig.1 Lifespan curves of female Drosophila melanogaster

2.2根皮苷對雙氧水和百草枯所致雌性果蠅急性氧化應激損傷的影響

圖2　根皮苷對急性氧化應激損傷雌性果蠅的影響Fig.2 Effect of phlorizin on oxidative stress-induced damage in female Drosophila melanogaster

如圖2a所示，飼喂根皮苷的雌性果蠅體內清除H2O2自由基的能力顯著提高，0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷組果蠅的平均存活時間較對照組分別延長了4.0%、17.4%和

23.9%，最高存活時間延長了3.9%、13.6%和18.7%。飼喂根皮苷的雌性果蠅抵抗百草枯氧化應激損傷的能力亦顯著提高（圖2b），0.5、2.0、5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅的平均存活時間較對照組分別延長了3.5%、10.7%和17.2%，最高存活時間延長了4.2%、12.7%和18.9%。

2.3根皮苷對雌性果蠅體內SOD、CAT酶活力和mRNA表達及MDA含量的影響

圖3　根皮苷對雌性果蠅體內Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活力和mRNA表達以及MDA含量的影響Fig.3 Effect of phlorizin on Cu/Zn-SOD, Mn-SOD and CAT activities, mRNA expression and MDA content in female Drosophila melanogaster

如圖3所示，與對照組相比，2.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT酶活力顯著升高（P＜0.05），5.0 mg/mL根皮苷組Cu/Zn-SOD、CAT酶活力極顯著升高（P＜0.01）；2.0 mg/mL和5.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內MDA水平極顯著降低（P＜0.01），且效果呈劑量依賴關系。與對照組相比，2.0 mg/mL根皮苷組雌性果蠅體內Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、CAT mRNA 表達水平顯著上調（P＜0.05），5.0 mg/mL根皮苷組Cu/Zn-SOD、CAT mRNA 表達水平極顯著上調（P＜0.01）。給藥組雌性果蠅體內MTH mRNA表達水平隨根皮苷劑量增加呈下調趨勢，其中5.0 mg/mL根皮苷組較對照組顯著下調（P＜0.05）。

3　討 論

飼喂根皮苷后，雌性果蠅的平均壽命和最長壽命均高于對照組，其中2.0、5.0 mg/mL根皮苷組較對照組雌性果蠅平均壽命及最長壽命均顯著延長（P＜0.05）；百草枯在細胞內活化產生的超氧陰離子自由基（O2－·）與H2O2產生的羥自由基（?OH）會誘導雌性果蠅產生急性氧化應激損傷。結果表明，根皮苷可以有效延長雌性果蠅的壽命以及減弱由H2O2和百草枯引起的急性氧化應激損傷。

抗氧化酶活力測定結果顯示，給藥組雌性果蠅體內SOD、CAT酶活力比對照組明顯提高，MDA含量較對照組明顯降低。SOD和CAT是生物體內清除活性氧的主要酶，這兩種酶相偶聯可以清除體內O2－·和?OH等活性氧，因此SOD和CAT的活力水平間接反映機體清除氧自由基的能力[12-13]，而MDA是自由基作用于不飽和脂肪酸而產生的脂質過氧化產物，通常作為機體脂質過氧化程度的指標[14-15]。Cui Xiaojing等[16]通過組織培養的方法研究發現根皮苷能夠有效改善西府海棠根系保護酶的活性，包括SOD、過氧化物酶（peroxidase，POD）、CAT等，并顯著降低MDA含量。董華強等[11]從甜茶多穗柯中制備并分離得到根皮苷，并證明用根皮苷灌胃糖尿病模型小鼠可以有效地降低小鼠血糖水平和提高抗氧化能力。根皮苷可以淬滅自由基和單線態氧[15,17]，防止脂質過氧化和DNA氧化損傷。根皮苷也可以有效減少大鼠肝細胞線粒體體外脂質過氧化，有效清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和2,2’-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS＋·）等過量自由基[18-19]。

Real-time PCR測定結果顯示，雌性果蠅體內抗氧化相關基因SOD、CAT等mRNA的表達水平顯著上調（P＜0.05），這與果蠅體內酶活力升高的趨勢相一致。Tolmasoff等[20]報道了SOD的活性與靈長類動物的壽命相關，研究表明超表達Cu/Zn-SOD和CAT的轉基因果蠅壽命比野生型長34%[21]，而單獨超表達CAT也能延長鼠科動物的壽命[22]。MTH mRNA表達水平呈下調趨勢，Baldal等[23]的研究表明敲除MTH內源性配體基因或者過表達MTH受體的肽類拮抗劑均能延長果蠅的壽命。這與Rezk[6]和Lee[19]等研究發現蘋果多酚和茶黃素等可以有效提高果蠅體內SOD、CAT等抗氧化酶相關基因表達水平、下調MTH表達水平，增強果蠅體內抗氧化酶活力，有效延長果蠅壽命的結果相一致。

根皮苷是蘋果含有的特征酚類物質，多以糖苷的形式存在[24-25]，現代藥理學研究表明根皮苷具有抗氧化[1]等生理功效。自由基學說是目前公認的衰老學說之一，自由基對細胞的各種成分和結構都可產生損傷效應，這些效應的累積勢必造成細胞功能的減退，可以說衰老是自由基損傷性效應的綜合結果。機體的抗氧化作用可保持自由基的產生與消除的平衡，對預防疾病與抗衰老等有重要意義。根皮苷具有較強的抗氧化活性，能夠顯著提高雌性果蠅的抗氧化能力，其機制很可能與根皮苷清除自由基、提高機體內抗氧化酶活性以及調控抗氧化基因mRNA的表達水平有關，但其具體的分子機制還需進一步深入研究。

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Effect of Phloridzin on Life Span of Female Drosophila melanogaster and Its Underlying Mechanism

ZHAO Jiang1, CHEN Chun1, HAN Xiaodong2, LIU Suwen3, MA Na1,4, WANG Hao1,*

(1. School of Food Engineering and Biological Technology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457; 2. Tianjin Jinjiu Group Co. Ltd., Tianjin 300131, China; 3. College of Food Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066600; 4. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457)

Abstract:Objective: To explore the effect of phlorizin on lifespan in female Drosophila melanogaster and its underlying mechanism. Methods: Two-day-old flies were reared in media containing 0, 0.5, 2.0 and 5.0 mg/mL phlorizin until they all died, and then the longest lifespan and mean lifespan were calculated. By paraquat and hydrogen peroxide acute experiments, the effect of phlorizin on oxidative stress injury in Drosophila melanogaster was determined. The antioxidant capacity of phlorizin was evaluated by the activities of superoxide dismutase (T-SOD and Cu/Zn-SOD), catalase (CAT) and malondialdehyde (MDA) content in fruit flies. Re al-time PCR was used to detect the expression of antioxidant genes. Results: Dietary addition of phlorizin could prolong the lifespan of Drosophila melanogaster (especially at 2.0, 5.0 mg/mL, P < 0.05). The Cu/Zn-SOD and CAT activities were significantly increased and MDA content was significantly decreased by dietary supplementation of 5.0 mg/mL phlorizin (P < 0.01). Moreover, a significant increa se in Cu/Zn-SOD and CAT mRNA expression (P < 0.01) was found. Conclusion: The anti-aging and antioxidant acti v ity of phlorizin is most likely related to the regulation of antioxidant gene expression.

Key words:Drosophila melanogaste; phlorizin; lifespan; antioxidant; enzyme activity; gene expression

doi:10.7506/spkx1002-6630-201507031

中圖分類號：TS201.4

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2015）07-0167-05

*通信作者：王浩（1979—），男，副教授，博士，主要從事食品營養學研究。E-mail：wanghao@tust.edu.cn

作者簡介：趙江（1963—），男，研究員，碩士，主要從事食品營養學研究。E-mail：tozjmail@163.com

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（31201322）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD33B05）；天津市高等學校科技發展基金計劃項目（20100609）；天津科技大學行業卓越人才實驗班專項（1314A216）

收稿日期：2014-05-30