三七重茬土壤中化感物質(zhì)的提取及活性研究

母 丹，龍秀麗，鄭麗絲，王志遠，趙 靜*

(1．玉溪師范學院資源環(huán)境學院，云南玉溪653100;2．德宏師范高等專科學校，云南芒市678400)

三七(Panax notoginseng(Bruk)F．H．Chen)又名田七，五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材。由于對環(huán)境要求的特殊性，三七主要集中分布于云南文山。三七是忌連作作物，一茬后土壤在幾年甚至幾十年內(nèi)都不能再栽。其中一個重要的原因就是化感作用。

化感作用是指一個活體植物向環(huán)境釋放一些化學物質(zhì)，影響周圍植物的生長和發(fā)育。這種作用包括促進和抑制兩種［1］。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，植物可通過根系分泌、根茬腐解、莖葉淋洗、微生物代謝活動等途徑向環(huán)境中釋放化感物質(zhì)［2］。Rice［3］把這些物質(zhì)歸為14類，其中最常見的為低分子量有機酸、酚類和萜類化合物［4］。曾有報道表明，三七連作土壤對白菜、蘿卜、萵苣的種子和幼苗均有抑制作用。

通過采用不同的萃取劑及方法，對三七重茬土壤中的化感物質(zhì)進行分離、提純，并且測定各組分對白菜種子萌發(fā)的抑制作用，初步明確三七化感物質(zhì)活性組分的萃取條件，并且初步明確重茬土壤萃取液對三七病原菌的化感作用。

1 材料與方法

1．1 材料 供試土壤采自云南省文山州大丫口三七種植基地。在連作3年以上的三七地塊上采集土樣。各地塊處于相鄰位置，土壤理化性質(zhì)基本一致。在每個地塊采用五點法采集三七根系下方土壤(0～20 cm)，混勻，共采集15分土樣。供試白菜種子為市售青島83-1。供試三七根腐菌(Fusarium solani)、三七疫病菌(Phytophthora cactorum)由云南農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室提供。

1．2 方法

1．2．1 超聲萃取法。用萃取劑五倍量提取500 g土壤，于超聲清洗機中萃取，溫度為25℃，頻率為160次/min，2 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，上XAD－4大孔吸附樹脂。用水及25%、50%和100%的萃取劑洗脫，分別收集各個濃度萃取劑的洗脫液，濃縮，定容至50 ml，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1．2．2 振蕩萃取法。用萃取劑五倍量提取500 g土壤，然后25℃、160 r/min振蕩24 h。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，上XAD－4大孔吸附樹脂。用水及25%、50%和100%的萃取劑洗脫，分別收集各個濃度萃取劑的洗脫液，濃縮，定容至50 ml，置于4℃冰箱內(nèi)備用。

1．2．3 生物活性檢測。將提取物稀釋100倍液，加入底部鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中。每皿放30粒預(yù)先用濃度0．5%高錳酸鉀消毒的白菜種子，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為25℃，濕度為70%，每24 h向各皿中加入2 ml左右蒸餾水以保持濕度。同時，每隔24 h記錄一次種子發(fā)芽數(shù)，以種子剛露芽為準，3 d后測量其根長。同時，以清水培養(yǎng)為陰性對照，以各萃取劑為陽性對照。

1．3 提取物對三七病原菌的化感作用 將提取的母液稀釋到100%、50%，經(jīng)無菌過濾器過濾后，分別將不同濃度的浸提液與熔融狀態(tài)下的PDA培養(yǎng)基混合后倒入培養(yǎng)皿中。以浸提劑乙酸乙酯的平板為對照(CK1)，以不加任何物質(zhì)的平板為空白(CK2)。

2 結(jié)果與分析

2．1 萃取方法對白菜種子萌發(fā)的抑制作用 分別采用2種萃取方法——超聲萃取法和振蕩萃取法，對三七重茬土壤的化感物質(zhì)的活性組分進行萃取。由表1可知，4種萃取劑于25℃、160 r/min振蕩24 h萃取的活性組分對白菜種子的萌發(fā)抑制作用更強，說明該萃取方法能夠萃取到土壤中更多的活性組分。

2．2 不同萃取劑對白菜種子萌發(fā)、根長的影響 分別用乙酸乙酯、甲醇、正丁醇、水4種萃取劑采用振蕩萃取法對三七重茬土壤的化感物質(zhì)的活性組分進行萃取。將萃取到的活性組分對白菜種子進行生物活性檢測。由表2可知，乙酸乙酯、甲醇、正丁醇3種有機萃取劑萃取到的活性組分對白菜種子的萌發(fā)均具有抑制作用，且萃取劑的濃度越高，萃取到的活性組分抑制作用也越強。其中，100%乙酸乙酯萃取組分的抑制作用最強，培養(yǎng)皿中30粒種子均不萌發(fā)，萌發(fā)率為0;正丁醇居中;甲醇最弱。而水萃取到的物質(zhì)對種子的萌發(fā)沒有抑制作用。

2．3 提取物對三七病原菌的化感作用 利用菌落的生長速率法，測定乙酸乙酯萃取液對三七根腐菌、三七疫病病菌的化感作用。由圖1、2可知，在作用時間為72 h時，濃度為100%處理的菌落直徑小于對照(CK1)和空白(CK2)。這說明乙酸乙酯萃取物質(zhì)對三七根腐菌和疫病病菌有不同程度的化感抑制作用，且疫病病菌受到的化感作用更強，菌落直徑明顯小于對照。隨著濃度的減弱，抑制作用降低。當濃度為50%時，菌落直徑略微高于對照(CK1)和空白(CK2)。

表1 不同萃取方法對白菜種子萌發(fā)的抑制作用

表2 不同萃取劑對白菜種子萌發(fā)、根長的影響

3 討論

由于云南文山種植三七歷史悠久，且種植面積廣泛，三七連作障礙嚴重影響當?shù)厝叻N植業(yè)的發(fā)展。目前，三七連作障礙的發(fā)生面積高達總種植面積的15%，每年由此造成的損失達上千萬元。連作障礙已成為三七栽培中亟待解決的難題［5］。現(xiàn)在，許多關(guān)于三七連作障礙的研究只是著手于病蟲害的治理與預(yù)防，很少研究其所具有的化感作用。

宋宇加［6］對栽培人參后土壤進行了化感物質(zhì)的萃取、檢測。在經(jīng)乙酸乙酯萃取的提取液中共鑒定出43種成分，而經(jīng)甲醇萃取的提取液中只鑒定出7種。這表明乙酸乙酯能萃取到的活性組分更多。而試驗中3種萃取劑對白菜種子的萌發(fā)均具有抑制作用，且乙酸乙酯的抑制作用最強，萌發(fā)率為0。經(jīng)乙酸乙酯萃取到活性物質(zhì)為脂肪烷烴類、芳香烴類、酮類、醇類、酸類、酯類。但是，試驗中經(jīng)乙酸乙酯萃取到的物質(zhì)種類還有待進一步研究。

研究還表明，隨著萃取物濃度的降低，對三七病原菌的化感作用呈降低的趨勢。這與曹陽［7］試驗結(jié)果相似，與王樹桐［8］等在對番茄灰霉病等具有抗菌活性的植物浸提液的研究結(jié)果也是一致的。化感物質(zhì)通常是多種成分共存的。化感作用是各類化感物質(zhì)和環(huán)境各個因子如土壤、溫度、水、營養(yǎng)物質(zhì)等綜合作用的結(jié)果，其中可能同時存在拮抗作用和協(xié)同作用［9］。

［1］HYDER PW，F(xiàn)ERDRIEKSON EL，ESTELL R E，et al．Tnars port of Phenolic compounds from leaf surface of creosotebush and tarbush to soil surface by Preci pitation［J］．Journal of chemical ecology，2002，28(12):2475－2482．

［2］E·L·賴斯．天然化學物質(zhì)與有害生物的防治［M］．胡敦孝，譯．北京:科學出版社，1988:19－28．

［3］RRCE E L．Allelopathy［M］．2nd ed．Orlando:Academic Press，1984．

［4］余叔文．植物間的相互作用:相生相克現(xiàn)象［M］//余叔文．植物生理與分子生物學．北京:科學出版社，1992:376－394．

［5］孫玉琴，韋美麗，陳中堅，等．化感物質(zhì)對三七種子發(fā)芽影響的初步研究［J］．特產(chǎn)研究，2008(3):44－46．

［6］宋宇加．人參根系分泌物及土壤中化感物質(zhì)的分離與鑒定研究［D］．長春:吉林農(nóng)業(yè)大學，2008．

［7］曹陽．西芹腐根及腐根際區(qū)物浸提液對黃瓜枯萎病菌化感作用的研究［D］．呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2009．

［8］王樹桐．對番茄灰霉病菌等具抗菌活性的植物浸提物的研究［D］．保定:河北農(nóng)業(yè)大學，2001．

［9］宋麗．大蒜(Alliumsativum L．)鱗莖粗提物對西瓜和黃瓜枯萎病的抑制效應(yīng)及其機理研究［D］．楊凌:西北農(nóng)林科技大學，2006．