一株豇豆花內生巨大芽孢桿菌的分離鑒定

熊燕妮，江瑞晶，方 浩，韓 雪，王 丹 (江漢大學生命科學學院，湖北武漢430056)

豇豆俗稱角豆，為蝶形花科1年生纏繞草本植物，在我國各地普遍栽培，深受廣大消費者的喜愛。內生菌是從表面消毒的植物組織中分離得到的，不使植物的表型特征和功能發生改變的微生物。植物內生菌可在植物體內定殖，從宿主植物中獲得養分和穩定的生長環境，不易受外界條件的影響，可長期發揮生物學作用［1－2］。內生菌在漫長地與植物共生進化的過程中已經可以很好地利用植株所提供的條件和植株的生長環境［3］;同時，有不少內生菌對植株本身產生有益的作用，內生菌與植株之間是共存互惠的關系［4］。目前，利用植物內生菌制備基因工程益生菌和基因工程生防菌已成為內生菌的研究熱點［5－6］。

筆者從武漢豇豆種植區篩選出豇豆花內生菌(whcfs1)，在豇豆花各花期花瓣中為優勢內生菌，可以在28～44℃生長。經染色，鑒定為革蘭氏陽性，芽孢桿菌，16S rDNA擴增產物序列分析為巨大芽孢桿菌，可以分解淀粉，在豆莢中并未分離出此菌。該內生芽孢桿菌有望成為豇豆基因工程益生菌、生防菌宿主菌株。

1 材料與方法

1．1 表面消毒處理 用燒杯取豇豆花沖洗表面污垢，移至無菌瓶中。用濃度0．1%升汞振蕩浸泡花3～4 min，用無菌水沖洗3～4遍，再用濃度75%酒精振蕩浸泡花3～4 min，無菌水沖洗5～6遍。

1．2 內生菌的分離 將表面消毒處理后的花移至無菌研缽中，減碎，加入生理鹽水和石英砂，研磨，2 000 r/min離心10 min，取上清涂布于NA培養基平板，取等量最后一次水洗的無菌水作為空白對照。在30℃恒溫培養箱中倒置培養48 h。取培養得到的單菌株做平板劃線，分離、提純并且保種。

1．3 革蘭氏染色 將菌液移至載玻片烘干、固定，結晶紫染色1 min，用革蘭氏碘液進行媒染1 min，酒精脫色，沖凈，番紅復染2 min，洗凈，用油鏡鏡檢。

1．4 芽孢染色 熱固定菌液，孔雀綠染色液加熱染色4～5 min，番紅復染，洗凈，用油鏡鏡檢。

1．5 細菌基因組抽提 細菌用沸水煮10 min，3 000 r/min離心10 min，取上清。

1．6 16Sr DNA擴增 采用16SrDNA通用引物為27F，5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和 1492R，5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。

1．7 聚合酶鏈擴增反應 利用特異性檢測引物，對提取的基因組進行PCR。PCR反應參數為:94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 45 s，72℃ 30 s循環30次，72℃10 min。

1．8 序列分析 16SrDNA測序結果經過Blast在Genebank中搜索相似序列，并且通過多序列對比軟件clustal分析，得到該菌種屬情況。

1．9 生長溫度范圍摸索 菌落涂于LB固體平板，在不同溫度培養箱中培養，觀察菌落生長情況，記錄菌落生長情況。

1．10 糖/酸發酵試驗 分別接種于糖發酵培養基中，置于37℃恒溫培養箱中培養16 h，另外保留一支不接種的培養基為對照。

1．11 硫化氫產生試驗 取檸檬酸鐵鹽半固體培養基，穿刺接種，置于37℃恒溫培養箱，培養24 h，觀察。

1．12 V．P試驗 接種于葡萄糖蛋白胨培養基中，置于37℃，培養24 h，觀察。在培養液中加入濃度40%KOH溶液10～20滴，然后加入等量的α-萘酚溶液，用力振蕩，再放入37℃恒溫箱中保溫15～30 min，觀察。

1．13 吲哚試驗 接種于蛋白胨水培養液中，置于37℃培養箱，培養24 h，觀察。觀察時，加入乙醚1 ml，充分振蕩，靜置待乙醚浮于上層時，沿管內壁慢慢加入吲哚試劑10滴，觀察。

1．14 檸檬酸鹽利用試驗 接種檸檬酸鈉斜面，置于37℃，培養24～48 h，觀察。

1．15 淀粉水解試驗 接種于淀粉培養基涂平板，于37℃恒溫箱，培養16 h，觀察。

1．16 油脂水解試驗 劃線于油脂培養基(花生油)上，于37℃恒溫箱培養16、24 h，觀察。

2 結果與分析

2．1 革蘭氏染色 在革蘭氏染色后，油鏡下可以看到菌體為短桿狀(圖1)，為革蘭氏陽性菌。

1．2 芽孢染色 由圖2可知，在視野下可見紅色的桿菌和綠色的芽孢，為芽孢桿菌。

2．3 16Sr DNA測序結果 由圖3可知，該內生菌為芽孢桿菌。從所構建的16SrDNA基因進化樹上來看，它屬于巨大芽孢桿菌。

2．4 生理生化試驗結果 根據生化試驗結果，發現分離得到的芽孢桿菌不能進行糖發酵，不能產H2S，V．P試驗和吲哚試驗結果為陰性，不能利用檸檬酸，不能分解油脂，但可以分解淀粉。

2．5 菌落生長溫度范圍 在LB固體培養基中，菌體營養體可在23～49℃溫度范圍內生長。

3 討論

植物內生菌的研究是現代農業微生物學的研究熱點。由于起步較晚，很多領域還有待研究，目前在豇豆中分離內生菌的報道仍是空白。該試驗分離得到一株豇豆花的內生巨大芽孢桿菌。它可以在豇豆花中定殖，在各期花中屬于優勢菌株，但在豆莢、豆、葉片和根系中沒有分離到。該內生菌生長溫度范圍寬，營養體可在23～49℃溫度范圍內生長，更適合武漢地區豇豆開花、結莢的夏秋兩季。16S rDNA測序結果顯示，該內生菌為巨大芽孢桿菌。生理生化試驗表明，該菌符合巨大芽孢桿菌的生化特征。研究表明，巨大芽孢桿菌具有解磷固鉀的功能，可用于生產有機肥，是植物良好的益生菌菌株［7－8］;此外，分離得到的豇豆花內生芽孢桿菌可在豇豆花中定植生長，同時可作為豇豆基因工程益生菌或基因工程生防菌的理想宿主菌株。

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