正交法優化廢次煙葉中水溶性多糖提取工藝

劉燮，羅健，張燕，田軍熊，譚小龍，涂云彪，陳波

(西昌學院農業科學學院，四川西昌615013)

我國是世界煙草種植大國，年產煙葉300萬t左右，占世界總產量約40%。每年生產的煙葉中有20%～30%為廢次煙葉［1－2］，這些煙葉不能用做卷煙原料，若無合理利用途徑，將造成巨大的浪費，也會造成環境的污染。廢次煙葉中含有多種活性化學成分，是生產保健品、食品、藥品、化妝品的重要原料［3－5］。因此，近年來廢次煙葉的綜合加工利用技術成為研究的熱點，其中對于煙堿、綠原酸、茄尼醇等的提取純化工藝研究較多［6－10］，但對多糖提取技術研究仍較少［11－12］。多糖是植物體內普遍存在的一類活性物質，具有增強免疫、抗氧化、降血壓等多種作用［13－16］。筆者以提取液中多糖含量為指標，比較不同的提取條件對煙葉多糖提取率的影響，旨在為進一步綜合利用廢次煙葉奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 材料 原料:廢次煙葉，2014年生產烤煙紅花大金元，由西昌學院農業科學學院提供。

主要試劑:濃硫酸、無水乙醇、蒽酮、硫脲、葡萄糖等試劑，均為分析純。

主要儀器:Q-506B2型高速多功能粉碎機，UNIVERSAL 320R型高速冷凍離心機，600型三用水箱，202-3A型電熱恒溫干燥箱，WP-RO-10型超純水機，KQ5200DE型數控超聲波清洗器，1900PCS型雙光束紫外可見分光光度計等。

1．2 試驗方法

1．2．1 原料預處理。將廢次煙葉置于60℃烘箱中烘干，將干燥后的煙葉除去煙梗，粉碎并過80目篩，于干燥器中保存備用。

1．2．2 水提取工藝及正交設計。準確稱取3 g預處理的煙葉粉末，放入200 ml三角瓶中，按照料液比(m/V)加入ddH2O，用玻璃棒攪拌均勻后，放入恒溫水浴箱中加熱，然后在4 000 r/min離心機中離心10 min，取上清液定容至100 ml，即得廢次煙葉多糖提取液。

選擇料液比、提取溫度、提取時間3個因素，各設4個水平(表1)，采用SPSSStatistics17．0的正交設計程序設計正交試驗，得16個處理，每個處理重復4次，每次重復平行測定4次，以提取液中多糖含量為評價指標，優選最佳水提取工藝，并進行3次重復驗證試驗。

1．2．3 超聲提取工藝及正交設計。除加熱設備改為KQ5200DE型數控超聲波清洗器(超聲波功率為30 kHz，電功率為200 W)而外，其余流程同“1．2．2”。

正交試驗選擇料液比、提取溫度、提取時間3個因素，各設4 個水平(表1)，設計方法同“1．2．2”。

1．2．4 酶法提取工藝及正交設計。在“1．2．2”的基礎上，處理體系中分別加入濃度為100 mg/ml的果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶各0．16 ml，放入恒溫水浴箱中加熱，其余工藝流程同“1．2．2”，正交試驗設計見表1。

1．2．5 多糖含量測定。參照文獻，采用蒽酮－硫酸法測定［17］煙葉提取液中多糖含量，蒽酮試劑現配現用，并加入硫脲做穩定劑。

1．3 數據處理 利用SPSS 17．0軟件的一般線性模型單變量分析程序處理試驗數據。

表1 正交試驗因素水平

2 結果與分析

2．1 葡萄糖標準曲線 準確取1 ml濃度分別為0．02、0．04、0．06、0．08、0．10、0．12、0．14、0．16、0．18、0．20 mg/ml葡萄糖標準溶液于具塞的試管中，再加入5 ml蒽酮試劑(立刻搖勻，并置于冰水浴中)，置沸水中水浴10 min，快速放入冰水浴中冷卻10 min，以蒸餾水為空白對照，在波長為626 nm處測定吸光度。根據測量結果計算線性回歸方程y=3．372 3x+0．215 3(R=0．965 6)。

利用標準曲線回歸方程，根據蒽酮－硫酸法測定的多糖吸光度A，可以計算出反應液中多糖的濃度C(mg/ml):C=(A －0．215 3)/3．372 3。

2．2 水提取工藝條件優化 水提取工藝正交試驗方差分析得出:F料液比=59．96＊＊，F提取溫度=46．72＊＊，F提取時間=7．54＊＊。由此表明，料液比、提取時間和提取溫度對多糖的提取影響均達到極顯著水平。3個因素對多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取溫度、提取時間。

水提取工藝的正交試驗結果表明(表2)，料液比、提取時間和提取溫度的最佳工藝條件為A2B4C4，即料液比為1∶15 g/ml，提取時間為105 min，提取溫度為90℃。正交試驗中，處理5(A2B1C2)，多糖含量最高，達到(9．02 ±0．50)mg/ml，其次為處理8(A2B4C1)，多糖含量達到(8．75 ±0．50)mg/ml，以及處理 6(A2B2C4)，多糖含量為(8．73 ±0．80)mg/ml。采用最佳工藝條件A2B4C4，進行3次重復驗證，提取液中多糖含量為(9．56±0．32)mg/ml，高于正交試驗的最高處理。

2．3 超聲提取工藝條件優化 方差分析得出，F料液比=224．04＊＊，F提取溫度=0．64，F提取時間=15．56＊＊。由此表明，在超聲提取工藝條件中，料液比和提取時間對結果影響極顯著，而溫度對多糖的提取影響不顯著。3個因素對多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取時間、提取溫度。

超聲提取工藝的正交試驗結果表明(表3)，料液比、提取時間和提取溫度的最佳工藝條件為A2B2C3，即料液比為1∶15 g/ml，提取時間為25 min，提取溫度為40℃。正交試驗中，處理5(A2B1C3)多糖含量最高，達到(10．57 ±0．15)mg/ml;其次為處理8(A2B4C2)，多糖含量達到(10．54±0．14)mg/ml;以及處理6(A2B2C1)，多糖含量為(10．13 ±0．43)mg/ml。采用最佳工藝條件A2B2C3進行3次重復驗證，提取液中多糖含量為(10．61 ±0．22)mg/ml，略高于正交試驗的最高處理。

表2 水提取工藝正交試驗結果

表3 超聲提取工藝正交試驗結果

2．4 酶法提取工藝條件優化 由方差分析得出，F料液比=175．14＊＊，F提取溫度=0．62，F提取時間=2．03。由此可知，在酶法提取工藝條件中，料液比對結果影響極顯著，而溫度和時間對廢次煙葉水溶性多糖的提取影響不顯著。3個因素對多糖提取的影響程度大小依次為料液比、提取時間、提取溫度。

酶法提取工藝的正交試驗結果表明(表4)，料液比、提取時間和提取溫度的最佳工藝條件為A1B1C2，即料液比為1∶10 g/ml，提取時間為50 min，提取溫度為40℃。在16個正交試驗中，處理2(A1B2C3)多糖含量最高，達到(8．78±0．70)mg/ml;其次為處理3(A1B3C4)，多糖含量達到(8．31 ±0．35)mg/ml;以及處理1(A1B1C1)和處理4(A1B4C2)，多糖含量分別為(8．28 ±0．34)mg/ml和(8．27 ±0．30)mg/ml。采用最佳工藝條件A1B1C2進行3次重復驗證，提取液中多糖含量為(8．56±0．41)mg/ml，略低于正交試驗的最高處理。

表4 酶法提取工藝正交試驗結果

3 結論與討論

多糖分子中含有大量羥基，具有較強極性，易溶于水，不溶于醇，因此利用此特性，采用水提醇沉法提取和純化多糖，是一種低成本、易操作、適合大規模工業生產的常規方法。水提取法需要通過加熱來使細胞壁膨脹裂解，從而有利于細胞內多糖的溶解。此外，還可以通過微波、超聲波等的機械作用破壞細胞壁，也可以添加果膠酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶等分解細胞壁，促進細胞內多糖的溶出，從而提高提取效率。超聲波和酶都可以起到破壞細胞壁、釋放細胞內容物的作用。當超聲功率和作用時間足夠時，溫度的作用可以忽略，因此在一定的超聲條件下，反應體系的溫度對提取效率的影響可能不顯著。酶具有生物活性，其活性程度具有最適溫度范圍，因此溫度在此范圍內的變化對提取效率的影響都不顯著。

該試驗分別采用水提取工藝、超聲提取工藝和酶法提取工藝提取廢次煙葉多糖。結果表明，超聲輔助工藝的提取效率最高，在最佳工藝條件下，提取液中的多糖含量可以達到(10．61±0．22)mg/ml;其次為水提取工藝，最佳條件下多糖含量可以達到(9．56±0．32)mg/ml;最后是酶法提取工藝，最佳條件下多糖含量為(8．56±0．41)mg/ml。3種工藝相比，超聲工藝提取效率最高，提取時間短、溫度低，但需要投入額外設備;水提取工藝提取效率居中，提取溫度最高，時間最長，但條件簡單，易操作;酶法提取效率最低，也需要輔助成本，但料液比低、溫度低、時間短。

水提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶15 g/ml，提取時間為105 min，提取溫度為90℃，提取多糖含量為(9．56±0．32)mg/ml;超聲提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶15 g/ml，提取時間為25 min，提取溫度為40℃，提取液中多糖含量為(10．61±0．22)mg/ml;酶法提取廢次煙葉多糖的最佳工藝條件為:料液比為1∶10 g/ml，提取時間為50 min，提取溫度為40℃，提取液中多糖含量為(8．56 ±0．41)mg/ml。

［1］王靜，王安亭．廢次煙葉的綜合利用研究［J］．洛陽大學學報，2007，22(4):51 －55．

［2］饒國華，趙謀明，林偉鋒，等．中國低次煙葉資源綜合利用研究［J］．資源科學，2005，27(5):120 －127．

［3］魏榮寶．煙草植物在有機醫藥和農藥中的應用［J］．化學教育，2009，30(9):1－4．

［4］趙保路．尼古丁預防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理研究［J］．生物物理學報，2007，23(2):81 －91．

［5］謝渝湘，劉強，張杰，等．煙堿預防帕金森氏綜合癥和老年癡呆癥的分子機理［J］．中國煙草學報，2006，12(4):25 －30．

［6］古君平，魏萬之．廢次煙葉中綠原酸的提取與分離［J］．煙草科技，2010(2):43 －47．

［7］朱松，婁在祥，陳尚衛，等．超聲輔助酶法提取廢次煙葉中綠原酸、煙堿工藝研究［J］．食品工業科技，2012，33(5):181 －184．

［8］朱松，陳尚衛，張海波，等．超臨界流體技術在廢次煙葉中提取純化茄尼醇的應用［J］．中國煙草學報，2008，14(5):22 －26．

［9］李英華，鄧天昇，杜俊民，等．煙葉浸膏中茄尼醇的提純［J］．煙草科技，2008(4):42 －45，59．

［10］艾心靈，王洪新，朱松．煙草中綠原酸、煙堿和茄尼醇的超聲波輔助提取［J］．煙草科技，2007(4):45－48．

［11］杜林洳，徐翠蓮，樊素芳，等．微波輔助提取廢次煙葉水溶性糖工藝［J］．科技導報，2010，28(13):92 －96．

［12］許春平，楊琛琛，王錚，等．低次煙葉多糖的提取及生物活性分析［J］．煙草科技，2013(11):52 －55．

［13］謝明勇，聶少平．天然產物活性多糖結構與功能研究進展［J］．中國食品學報，2010，10(2):1 －11．

［14］方積年，丁侃．天然藥物:多糖的主要生物活性及分離分離純化方法［J］．中國天然藥物，2007(5):338 －347．

［15］韓偉，張玲玲，黃兮，等．桑葚多糖的絮凝純化及其抗氧化性［J］．南京工業大學學報，2014，36(1):97 －101．

［16］徐偉麗，崔鵬舉，魯兆新，等．玉米麩皮多糖對人結腸癌HT-29細胞增殖的抑制作用［J］．哈爾濱工業大學學報，2015，47(2):62 －66．

［17］王黎明，夏文水．蒽酮－硫酸法測定茶多糖含量的研究［J］．食品科學，2005，26(7):185 －188．