西瓜抗枯萎病種質資源的分子標記篩選研究

王吉明，李楠楠，尚建立，李娜，徐永陽，馬雙武

(中國農業科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州450009)

西瓜枯萎病是由半知菌亞門鐮孢屬尖孢鐮刀菌西瓜專化型(Fusarium oxysporum f．sp．niveurn)寄生引起的一種世界性真菌土傳病害，嚴重制約西瓜的生產［1-4］。目前西瓜抗枯萎病育種主要采用人工接種鑒定技術進行抗性選擇，易受環境和接種技術的影響，存在鑒定時間長、準確性差、鑒定效率低等缺點，分子標記技術鑒定具有不易受環境影響，鑒定時間短，準確性高，鑒定效率高等優點，可作為分子輔助選擇的重要工具，隨著分子生物學的發展，研究者已對西瓜枯萎病病菌1號生理小種的抗病基因(Fon-1)進行定位［5-8］。筆者采用張屹等［8］發表的西瓜枯萎病生理小種1抗性基因緊密連鎖Caps標記“fon_7716”對130份不同類型西瓜種質進行抗性基因分子檢測分析，以期為西瓜抗枯萎病抗原篩選和分子輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1．1 試驗材料 供試材料為國家西瓜甜瓜中期庫(河南，鄭州)提供的西瓜種質資源，包括地方品種、育成品種(系)和野生種質，共計130份(表1)，具有較為廣泛的代表性。

1．2 試驗方法

1．2．1 DNA提取。于西瓜果實膨大期取蔓上幼嫩真葉用于基因組 DNA的提取，采取 CTAB法提取基因組 DNA［9］。

1．2．2 PCR 反應體系。擴增反應體系 25 μl，包括 12．5 μl 2×Taq Master Mix，2 μl模板 DNA，10 μmol/μl上、下游混合引物2μl，ddH2O 8．5μl。擴增反應程序:94℃預變性 5 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個循環;72℃延伸5 min;4℃保存。2×Taq Master Mix購自北京百泰客生物技術有限公司。引物7716_fon為張屹等［8］已發表的西瓜抗枯萎病基因分子標記，由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。7716_fon 引 物 序 列 為:5′-TTAAAAATCATCTCCTCTTTAAAACTATT-3′，5′-ATATATTTGGTCTCCGAGTGTTCAA-3′。

1．2．3 CAPS反應與分析。PCR產物采用 Taq I進行酶切，酶切識別位點為T′CGA，酶切體系為 15 μl，含有 1．5 μl 10 ×Buffer;1．0 μl限制內切酶Taq I;5 μl PCR 產物，7．5 μl H2O。酶切程序:65℃酶切16 h，80℃變性20 min，4℃保存。限制性內切酶購自Fermentas公司。

擴增/酶切產物采用8．0%聚丙烯酰胺電泳，280 V恒定電壓下電泳50 min，銀染顯色后拍照分析;PCR產物酶切后電泳出單條帶170 bp判定為抗病基因型，出現單條帶104 bp為感病基因型，同時出現170和104 bp 2條帶為抗/感病雜合基因型。

2 結果與分析

2．1 PCR及Caps酶切結果 130份西瓜種質資源的總DNA提取后均擴增出170 bp條帶，但條帶較淺;采用Taq I酶切后部分種質的PCR產物出現104 bp條帶和一條70 bp左右的條帶，將170 bp和104 bp條帶判定為抗病和感病基因型(圖1)。

2．2 種質資源基因型鑒定 在130份種質資源中，45份種質資源表型為抗病基因型(+)，80份種質資源為感病基因型(-)，5份種質資源為抗/感病雜合基因型(+/-)(表1)。

2．2．1 地方品種基因型鑒定。在34份地方品種類型種質資源中，21份種質鑒定為抗病基因型，占供試地方品種總數的61．8%。抗病基因型種質包括著名的地方品種三白瓜、撫州瓜、馬鈴瓜、喇嘛瓜、陜西白、黑崩筋等食用西瓜，以及鄭州籽瓜、大板紅籽瓜、皋蘭籽瓜、寧夏紅籽瓜、大安子瓜等籽瓜。

2．2．2 野生種質資源基因型鑒定。選用13份野生種質進行了抗性基因型鑒定，結果鑒定出3份抗病基因型種質，分別為PI 494530、PI 494528、PI 595203，占供試野生種質總數的23．1%，其余均為感病基因型種質。

2．2．3 育成品種基因型鑒定。在82份育成品種(系)類型種質資源中，鑒定出21份抗病基因型種質，主要為久比例、Smokylee、Sugarlee等國外育成品種，以及紅1號、中育10號、中育1號和96B41等國內育成品種(系)，占供試育成品種(系)種質總數的25．6%;另鑒定出5份雜合基因型種質，分別為 Jan-06、All Sweet、Dixielee、開雜5 號-1、AB 系;其余為感病基因型種質，主要為查理斯頓、Black Stone、Calhoun Gray、Black diamond、Crimson Sweet等國外育成品種和中育9號、興城紅、火洲1號、無杈早、蘇蜜1號、中汴一號等國內育成品種。

表1 西瓜種質資源抗枯萎病生理小種1基因型鑒定

續表1

3 討論

該研究采用Caps標記“Fon_7716”對我國部分西瓜種質資源包括地方品種、野生種質、育成品種(系)3種不同類型的種質資源進行了抗枯萎病生理小種1的基因型鑒定，結果表明抗性基因型種質比例偏高，如我國地方西瓜品種通常認為不抗枯萎病，但在34份我國地方西瓜品種中，有21個品種表現為抗病基因型，抗性種質比例高達61．8%，表明抗性基因型和表型抗性性狀之間出現一定的偏差，推測不同類型種質資源之間存在較大的抗性背景遺傳差異，有待進一步研究;此外一些公認的抗性種質如PI296341是目前認為兼抗枯萎病生理小種0、1、2的材料，而Calhoun Gray則是開發“Fon_7716”標記的抗性親本材料，這些種質在該研究中均表現為感病基因型，出現這種情況可能與采用的試驗材料與之前報道用的材料來源不同，或在繁殖更新過程中抗性基因丟失有關。在育成品種(系)中，Sugarlee、Smokylee、紅1號等是抗枯萎病育種中較為常用的抗性材料，該研究鑒定為抗病基因型，與表型抗性性狀相符。

不同西瓜種質資源材料其抗病基因可能各不相同，抗性遺傳和表型規律也相差很大，枯萎病抗性遺傳可能受多個基因協同控制［10-18］，采用單一分子標記難以全面從整個種質資源角度篩選和鑒定抗性種質，因此十分有必要繼續從分子水平開展枯萎病的抗性遺傳和抗性機理研究，并開發更多緊密連鎖的分子標記。

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