數字微流控生化芯片多液滴稀釋方法的研究＊

張 玲，梅軍進

（湖北理工學院計算機學院，湖北 黃石435003）

1 引言

片上試驗室LOC（Lab－On－a－Chip）是近年來為進行重大藥物研制而出現的一種新的生化試驗模式［1～5］。LOC通常在一個只有幾平方厘米的小芯片上運行一個或多個生化試驗協議或者生化檢測，但這個小小的芯片卻涉及多個交叉領域，包括微電子、生物化學、病毒診斷、計算機輔助設計、制造等領域，與傳統的試驗過程比較，LOC 非常節省樣品和試劑，并且不容易出人為錯誤，結果較準確［1，5～7］。

樣品試劑的配備過程是生化試驗中最常用且必需的基本操作，傳統的LOC 無法將樣品配備放在片上進行，需要片外準備，給整個LOC試驗過程造成延期。而對于DMF（Digital MicroFluidic）的芯片，則可以通過設計片上協議來進行樣品配備，通過控制離散的液滴多次混合/分離操作而獲得目標樣品。樣品配備一般通對儲備的原溶液進行稀釋來獲得各種目標濃度溶液［8］。如何通過最少的步驟且產生較少的廢棄液滴獲得目標溶液是樣品配備的一個挑戰［9］。

DMF生化芯片通常在一個二維電極陣列上通過控制離散的液滴運動來實現相應的生化試驗，因此，相應的控制液滴為單位液滴的整數倍，其中單位液滴（Unit Volume）為電極陣列控制的液滴單位。混合操作可以抽象為（k∶l）的模式，代表k個單位的物質1和l個單位的物質2同時參與混合操作，獲得（k＋l）單位的混合物［9］。若用CF來表示結果濃度，稀疏過程可以描述為給定濃度為100%的試劑或樣品和給定濃度為0%的中性溶液，確定一系列的（k∶l）模式的混合過程來達到所需要目標濃度。

已有的基于數字微流控芯片的混合方法均是基于兩液滴混合/分離模式［9，10］，即（k∶l）＝（1∶1）。二進方法BS（Bit Scanning）［10］提出利用兩液滴混合的（1∶1）模式對兩種物質進行混合以獲得目標濃度，它用二進制數來闡述所產生的中間濃度和目標濃度，從而通過掃描二進制串來實現所有的混合/稀釋步驟，它可以在誤差允許內獲得目標液滴濃度。但是，其每次的混合操作都是以原液滴濃度液滴作為混合液滴之一來獲得目標液滴濃度，經過了較多的中間步驟才能獲得目標濃度。為了進一步減少混合/分離操作和所產生的廢氣液滴，文獻［9］提出用類似折半查找的混合/分離方法不斷向目標液滴濃度靠近的方法，即假設參與混合的兩個濃度Cl和Ch液滴混合，得到新的濃度為C1＝（Cl＋Ch）/2，將目標液滴濃度Ct與新獲得的液滴濃度C1進行比較，若Ct的濃度小于C1，則下一次參與混合的液滴濃度為Cl和C1，獲得新的液滴濃度（Cl＋C1）/2；若Ct的濃度大于C1，則下一次參與混合的液滴濃度為C1和Ch，獲得新的液滴濃度（Ch＋C1）/2；繼續這個混合過程，Ct的濃度與C1相等或在誤差允許范圍之內，相應的Ct就是最終的目標濃 度。圖1 給 出 了BS［10］和 二 進 搜 索［9］混合/分離的例子，目標濃度為313/1024。如圖1a所示，BS 方法［10］每次將新的濃度與原濃度比較，最終獲得目標濃度；圖1b折半搜索［9］每次用折半查找來逐漸獲得目標液滴。雖然BS 方法和二進搜索方法都減少了混合/分離的步驟獲得目標液滴，但考慮數字微流控的可配置型，用兩液滴混合模式操作經歷過多的操作步驟，不僅增加了在線操作時間，而且產生了較多的廢棄液滴，浪費了藥品。

Figure 1 Conventional two droplets mixing operations for 313/1024圖1 傳統的兩液滴混合模式313/1024

為了實現樣品試劑配備過程，減少混合/稀釋步驟和相應的稀釋時間，并減少中間廢棄液滴，本文充分利用數字微流控的可配置性，利用數字微流控多液滴混合器資源進行樣品配備，使用較少步驟完成混合/稀釋操作，獲得目標濃度的液滴。實驗結果表明，該多液滴混合方法可以高效地完成混合/稀釋操作，獲得目標濃度液滴，同時減少中間廢棄液滴的數目。

2 多液滴參與稀釋混合器操作

數字微流控芯片的最大特點就是其可重用性和可配置性，也就是說可以根據需要將生化操作協議映射到芯片上，并在運行完后運行其它生化試驗［9］，因此很容易在片上設置多液滴混合器。假設片上混合器允許n（n＞2）個液滴同時參與混合操作，要獲得的目標濃度為Ct，則多液滴混合/分離獲取目標濃度問題可以描述為：

輸入：給定兩種濃度Cl和Ch，目標濃度為Ct，并且0≤Cl＜Ch≤1。

輸出：從Cl和Ch開始混合獲得目標濃度Ct所需要經歷的混合/分離操作M，例如M＝mix＿split（X，Y），而X、Y為某個中間濃度或者兩個給定濃度產生的中間濃度的廢棄液滴的數目。

多液滴混合/分離操作的算法可以描述如下：在每一次設計混合/分離操作時，先計算當前已有資源可以獲得的所有濃度，再依次與目標濃度比較，選取具有較小范圍且較接近的濃度所對應的操作為當前的混合/分離操作，并更新相關的參數，以進行下一次的混合/分離設計。具體算法如下：

算法1 多液滴混合操作算法

如算法所描述，多液滴混合/分離操作允許多個液滴同時參與操作，所以在每一次的混合/分離操作之前，必須先確定當前參與混合的兩個濃度Cl和Ch的比例。將Cl和Ch兩種濃度一次混合/分離操作可以獲得的目標濃度表示為集合tempn＝｛d1，d2，d3，…，dn－1｝，其中d1＝（Ch＋（n－1）Cl）/n，d2＝（2Ch＋（n－2）Cl）/n，d3＝（3Ch＋（n－3）Cl）/n，dn－1＝（（n－1）Ch＋Cl）/n，如步驟（1）所示。將集合元素逐個與目標濃度Ct比較，其最小的差值表示為diffmin，diffmin若不在誤差允許范圍內，則繼續下一個步驟，否則算法結束，這個過程如算法的步驟（2）所示。為了用較少的混合/分離步驟獲得目標液滴，對集合tempn進行排序，并與目標濃度Ct進行比較，若Ct處于某兩個濃度之間，則分別計算使用這兩個濃度的搜索范圍（dj－Cl）與（Ch－di）的大小，根據較小范圍更新Ch或Cl；而若所有濃度均小于Ct，則更新Cl；否則所有濃度均大于Ct，則更新Ch，更新后轉（1），這個過程如步驟（4）所描述。接著繼續新的混合/分離過程，直到diffmin在誤差允許范圍之內，獲得目標濃度。

表1給出多液滴混合/分離算法的一個例子，該例子用4液滴混合器對樣品進行稀釋，初次參與混合/分離的較低濃度和較高濃度分別為Cl＝0/1024，Ch＝512/1024，要獲得的目標濃度為Ct＝313/1024，要求誤差為0。根據多液滴稀釋算法，首先計算Cl和Ch經過一次混合/分離操作可以獲得的濃度集合tempn＝｛768/1024；512/1024；256/1024｝，選擇dj＝d2對應的操作作為當前操作，即1個液滴的Cl和1個液滴的Ch進行混合/分離，并更新Ch＝512/1024，這個過程對應于表1 的第一行；接著轉第一步，進行新一輪的混合/分離操作，更 新tempn＝｛128/1024；256/1024；384/1024｝，計算后選di＝d2作為當前操作，即1個液滴的Cl和1個液滴的Ch混合/分離，經過計算更新Cl＝256/1024，這個過程對應表中第二行；接著同樣的步驟，直到誤差為0，獲得目標液滴。圖2給出了該方法獲得目標濃度313/1024的操作過程示意圖，多液滴混合/分離方法需要的樣品液滴個數（濃度為1024/1024的液滴）為2，產生的廢棄液滴（沒有用到的中間液滴，如圖2中的三角形所示）為5個，而所需要的緩存個數（產生后沒有被立刻用到，但在后邊的步驟要用到的液滴，如圖2中的正方形所示）為5，所需要的混合/分離的步驟為7步。

由圖2可見，獲得同樣的濃度，與圖1所示的兩種方式比較，多液滴稀釋方法不僅節省了藥品，產生較少的廢棄液滴，所需的緩存單元和混合/分離的步驟也有所減小。

該算法利用數學分析準確計算所需要的混合/稀釋步驟，再利用數組微流控芯片進行操作，可以準確獲得目標液滴。另一方面，假設找到了符合誤差的目標濃度為C，則以C濃度為密度將濃度中性溶液到源溶液平均分為m段，則利用n液滴混合法找到該目標濃度的算法復雜度僅為O（logn（m））。

3 實驗結果和分析

為了驗證本方法的有效性，實驗分別用折半搜索［9］和多液滴稀釋方法對多個在1/1024到1023/1024之間的目標濃度進行了實驗，其中實驗用到的是4液滴混合器，實驗結果在圖3、圖4 和表2給出。

Table 1 Mixing operations of the target droplet with Ct＝313/1024表1 Ct＝313/1024利用多液滴混合算法的過程

Figure 2 Illustration of target droplets with 313/1024operations圖2 獲得313/1024目標濃度用4液滴混合器混合過程示意圖

圖3和圖4分別給出了為獲得目標濃度96/1024和127/1024，分別用折半搜索［9］和多液滴稀釋方法的操作示意圖，其中圖3a和圖4a為折半搜索方法的示意圖，同時給了所需的操作步驟數、所用樣品液滴、廢棄液滴及所需存儲的液滴的個數；而圖3b和圖4b給出本文提出的多液滴稀釋方法的示意圖，其中三角形和方框分別代表對應位置產生廢棄液滴和需要存儲緩沖液滴。從圖3 和圖4中可以明顯看出，多液滴混合稀釋方法不僅減少了操作步驟，而且減少了廢棄液滴，同時獲得了較多的目標液滴。

表2給出了其他多個在1/1024到1023/1024之間的目標濃度的實驗結果比較，其中＃d/m、＃sd、＃wd、＃bud和＃td分別代表所需要的混合/分離步驟、需要的樣品液滴個數、產生廢棄液滴的個數、所需要存儲的緩存液滴個數、獲得的目標液滴個數。為了更好地比較兩種方法的效率，表2中還給出了所用的樣品液滴和獲得的目標液滴的比率ratio，其中ratio＝＃sd/＃td，代表＃sd個樣品液滴經過多個混合/分離步驟獲得＃td個目標濃度的液滴。從結果可以看出，多液滴混合/分離的稀釋方法不僅使用較少的步驟獲得目標液滴、產生了較少廢棄液滴，而且具有較高的效率。

Table 2 Comparison of target droplets achievement表2 獲取目標液滴操作情況的比較

Figure 3 Illustration of target droplets with 96/1024operations圖3 獲得目標濃度96/1024操作過程比較示意圖

4 結束語

本文針對數字微流控生物芯片提出樣品試劑配備的優化過程，利用多液滴片上混合器進行目的濃度的液滴配備。該方法先計算當前資源可以獲得的濃度集合，再根據此濃度集合與目標濃度的關系分三種情況進行操作選擇和下一次的操作數據更新，直到獲得誤差允許下的目標濃度。實驗結果表明，本方法不僅可以在誤差允許范圍內高效地進行目標濃度的配置，而且減少了需要的操作步驟和廢棄液滴，減少了樣品配置時間。

Figure 4 Illustration of the target droplets with 127/1024operations圖4 獲得目標濃度127/1024操作過程比較示意圖

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