膈下逐瘀湯加減方作用人肝癌細胞SMMC-7721 蛋白質組學研究*

李華成 王建剛 費新應△ 汪建平

1.黃石市中醫醫院(傳染病醫院)肝病科 (湖北 黃石，435100) 2.湖北中醫藥大學(湖北 武漢，430065) 3.華中科技大學同濟醫學院藥學院 (湖北 武漢，430030)

原發性肝癌(簡稱肝癌)是一種惡性程度高、進展快、預后差的惡性腫瘤，其全球發病率和死亡率分別列所有腫瘤的第7位和第4 位［1］。我國是乙型肝炎高發區，肝癌發病率占全球總數的55%，近80%患者確診時已屬中晚期，5年以上長期生存率僅為10%左右［2］。我們運用膈下逐瘀湯加減方(以下簡稱GXZY)治療肝癌，發現能夠提高患者的生存率，可以改善患者生活質量，且沒有明顯的毒副作用［3］。前期實驗研究顯示膈下逐瘀湯加減方對肝癌H22荷瘤小鼠有明顯抑制作用［4］，并可以抑制人肝癌細胞SMMC-7721 的增殖，誘導SMMC-7721 細胞凋亡，抑制SMMC-7721 細胞端粒酶活性，調控癌基因活化與抑癌基因失活，阻止腫瘤細胞的無限繁殖［5，6］。本研究從蛋白質組學的水平探討膈下逐瘀湯加減方對肝癌的作用機制，尋找其藥效作用的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與細胞 健康SD 大鼠20 只，SPF 級，雌雄各半，體質量(250 ±20.9)g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，實驗動物質量合格證編號:No.42009800000170-42009800 000172;人肝癌細胞株SMMC-7721 購自中國科學院細胞庫。

1.1.2 實驗用藥 GXZY 由五靈脂、桃仁、赤芍、紅花各6g，當歸、川芎、丹皮、玄胡、甘草各10g，龍葵、茯苓各20g，蜈蚣3g，薏苡仁30g 組成。GXZY 湯制備及提取流程:加水煎煮，濃縮得藥液，濃度為3g/ml，置冰箱中備用。

1.1.3 主要試劑及儀器 固相pH 梯度IPG 干膠條(pH 4～7，24 cm Bio-Rad 公司，美國);除白蛋白和球蛋白試劑盒(Merck，美國公司);蛋白沉淀試劑盒(Merck，美國公司);HRP 標記的山羊抗兔IgG(KPL 公司);ABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德公司);ECL 化學發光系統(碧云天生物技術研究所);Cocktail 蛋白酶抑制劑(Roche 公司);ReverTra Ace 定量PCR 試劑盒(TOYOBO 公司，日本);Trizol Reagent RNA 提取試劑盒、PCR 引物(Invitrogen 公司，美國);IPGphor 等電聚焦儀、垂直電泳槽(GE Healthcare 公司，美國);JY96-Ⅱ超聲儀(寧波新芝公司);超凈工作臺(蘇州蘇凈安泰);Ultraflex ⅢTOF/TOF 質譜儀(Bruker Dalton，德國);UMAX Powerlook 1100 掃描儀(力捷，臺灣);ImageMaster 2D platinum 5.0 圖像分析軟件(GE 公司，美國)

1.2 方法

1.2.1 動物模型及藥物血清制備 將20 只SD 大鼠隨機分為空白對照組、GXZY 血清組(各10 只)?？瞻讓φ沾笫竺咳展辔干睇}水5ml/只，GXZY 組大鼠每日灌胃10ml/kg GXZY 藥液，均連續灌胃3d。于第3d 最后一次灌胃后1h(灌胃前12h 禁食)股動脈采血，3 000rpm，20min 離心，合并同組動物血清，用0.221μm微孔濾膜過濾除菌，于56℃、30min 水浴滅活，并用完全培養液配成10%的GXZY 血清培養液以及無藥血清培養液，4℃保存，兩周內使用。

1.2.2 細胞培養條件與處理 人肝癌細胞株SMMC-7721 接種于含10%小牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml 鏈霉素的RPMI-1640 完全培養液中，在37℃、含5%CO2培養箱內培養，并用0.25%胰蛋白酶消化傳代，接種于6 孔培養板，每孔5×105個細胞，每組均設為6個平行孔。培養24h 至細胞生長旺盛后，去培養液，隨機分為兩組，GXZY 血清組(加入GXZY 含藥血清培養液)、空白對照組(加入無藥血清培養液)，繼續培養48h 后結束。

1.2.3 細胞蛋白質樣品制備 按除白蛋白和球蛋白試劑盒的說明書進行高豐度蛋白去除，預處理后的樣品采用Bradford 蛋白定量方法進行蛋白定量。

1.2.4 雙向凝膠電泳(2-DE)和圖像分析 按Bio-Rad 公司雙向凝膠電泳手冊進行。第一向固相pH 梯度等電聚焦，膠條經兩步平衡后轉移至12.5%的均勻膠上進行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，運用ImageMaster 2D platinum 5.0 圖像分析軟件進行電泳圖分析。

1.2.5 MALDI-TOF-MS 質譜分析 將差異表達的蛋白質點從膠上切下，經脫色、真空離心干燥、Trypsin 酶切萃取兩次，將萃取液冷凍真空抽干后以3μl 50% ACN/0.5% TFA 水溶液復溶，加入過飽和基質溶液3 μl，混勻后取2 μl 點樣于不銹鋼靶板上，空氣自然干燥后備用。利用Bruker Dalton Ultraflex III TOF/TOF 質譜儀進行質譜分析。UV 波長為355nm，重復速率為200HZ，加速電壓為20000V，最優質量分辨率為1500Da。掃描質量范圍為700～3200Da，收集信號。胰酶自切峰為內標校正質譜儀。所有實驗樣品的質譜圖均以默認模式獲得。利用軟件Bruker Dalton flexAnalysis 過濾基線峰、識別信號峰，Bruker Dalton BioTools 軟件搜索NCBI 數據庫，尋找匹配的相關蛋白質，同時查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質為何種蛋白質。

2 結果

2.1 2-DE 圖譜結果分析 GXZY 含藥血清組和空白對照組2-DE 圖譜經過ImageMaster 2D platinum 5.0 軟件分析，獲得兩組間差異表達的蛋白質點66個，其中GXZY 血清組的蛋白電泳圖譜上有33個蛋白質點高表達，空白對照組的蛋白電泳圖譜上有33個蛋白質點高表達。其中部分差異表達明顯的蛋白質點2-DE 放大圖譜結果見圖1。

圖1 部分差異表達蛋白質點2-DE 圖譜放大結果(圖1 中1～6 處的蛋白質名稱見表1)

表1 差異蛋白質點的質譜鑒定結果

2.2 差異表達蛋白質點的質譜鑒定 根據圖像分析，選取10個差異表達顯著的蛋白質點經膠內酶解后進行MALDI-TOF-MS分析，獲得肽質量指紋圖譜，利用BioTools 軟件搜索NCBI 數據庫，結果顯示有6個蛋白質點得到鑒定，其中與空白對照組比較，GXZY 血清組有5個蛋白質點表達下調，1個蛋白質點表達上調。差異表達蛋白質點質譜鑒定結果見表1。

3 討論

中藥復方具有多靶點、多途徑、多層次作用的特點，傳統研究方法不能從整體水平研究中藥復方的治療機制。蛋白質組學的誕生與發展，可以在整體水平上發掘肝癌發病機制、早期診斷、預后判斷的蛋白標志物，并尋求潛在藥物作用靶點，在肝癌臨床診斷和治療方面有十分誘人的前景［7］。隨著高分辨率的2-DE 分離及質譜分析等蛋白質研究技術的發展，蛋白質組學的差異蛋白質組分析成為篩選中藥作用靶點的一種有效手段，已大量應用于中藥新藥研究［8］。

PGAM1 即磷酸甘油酸變位酶1，是糖酵解過程重要的酶之一，主要催化3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸的過程。腫瘤細胞內糖酵解過程較正常細胞活躍，在這過程中涉及的多種酶常表達異常。Ren F［9］等對肝細胞癌組織及肝正常組織研究發現，PGAM1 在66.7%的肝細胞癌組織中被發現顯著上調。本研究結果發現，空白對照組細胞中PGAM1 表達顯著上調，而經GXZY 藥物血清處理的細胞表達下調，提示GXZY 可能抑制肝癌細胞能量代謝過程，阻止癌細胞生長。

STMN1，也稱癌蛋白18，是一種普遍存在，高度保守，分子量為19kD 的胞質磷蛋白。多種惡性腫瘤中STMN1 都有高水平表達。甘淋等［10］研究發現stathmin 的表達下調可抑制肝癌細胞HCCLM3 的增殖，誘導其凋亡，以及抑制其黏附、運動和侵襲。本研究發現，GXZY 血清組細胞STMN1 表達下調，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

Tropomyosin(TPM)，即原肌球蛋白，是肌肉收縮過程中重要的調節蛋白質，在骨骼肌和平滑肌細肌絲中，與肌動蛋白雙螺旋并行存在，可影響并調控肌動球蛋白之間的相互作用［11］。TPM 在調節細胞能動性，細胞移動和誘導內皮細胞凋亡等方面起著重要作用，參與腫瘤生長和轉移過程［12］。原肌球蛋白4(TPM4)是已經確認的4 種基因(TPM1，TPM2，TPM3 和TPM4)編碼的蛋白質家族中的一個［13］。眾多惡性腫瘤包括卵巢癌、前列腺癌、口腔立方上皮癌等，以及非小細胞肺癌、結腸癌，TPM均表達下降［14］。本研究結果中，GXZY 血清組細胞TPM4 呈表達上調，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

熱休克蛋白90(HSP90)是維持細胞內蛋白構象穩定與功能正常所必需的分子伴侶，有HSPα、HSPβ 兩種亞型。許多信號轉導蛋白的正常功能發揮都依賴于HSP90。正常細胞中HSP90 是受細胞周期調控的，但在腫瘤細胞中，HSP90 呈現持續的高誘導表達，在調節腫瘤細胞周期、增殖、分化等方面有著重要作用，成為抗癌藥物作用的靶點［15，16］。本研究結果中GXZY血清組細胞HSP90β 呈表達下調，提示該蛋白可能為GXZY 的作用靶點。

突觸囊泡膜蛋白同源蛋白(VAT1)在胚胎發育中依次在三叉神經簇、后腦、神經管和松果體中表達，在受精后24h 可在發育腸管中檢測到。在發育最后階段在神經管中的表達缺失，而仍可在大腦、視網膜和咽腔中檢測到。腺苷高半胱氨酸水解酶(AHCY)是已知唯一的催化腺苷高半胱氨酸(SAH)分解為同型半胱氨酸(高半胱氨酸，Hey)和腺苷的酶。具有調節細胞內甲基循環代謝的重要作用，其酶的活性功能與細胞中磷脂、蛋白質、DNA、RNA 和其他小分子的甲基化作用密切相關，一旦酶活性下降或者被抑制，細胞本身的磷脂、蛋白質和核酸等的代謝就會受到影響，進而影響細胞生命的正常代謝［17］。陳寧［18］曾研究發現VAT-1 在高轉移肝癌細胞中表達上調。這兩種蛋白質目前國內研究報道較少，本研究結果顯示他們在空白對照組細胞中表達上調，而在GXZY 藥物血清組表達下調，提示它們可能是肝癌新的標記蛋白及GXZY 的作用靶點。

［1］高姍，楊萬水，高靜，等.原發性肝癌的分子流行病學研究進展［J］.中國腫瘤，2012，21(2):136 -144.

［2］張愛英，劉秀紅，張永宏，等.肝癌血清標志物研究進展［J］.現代生物醫學進展，2014，14(25):1981 -1983.

［3］費新應，黃廷榮，沈震，等.膈下逐瘀湯輔助治療原發性肝癌的臨床觀察［J］.湖北中醫雜志，2006，28(1):34.

［4］黃廷榮，費新應，余珊珊，等.膈下逐瘀湯加減方對肝癌H22 荷瘤小鼠的作用［J］.中國中西醫結合雜志，2007，15(5):326 -328.

［5］費新應，黃廷榮，李世林，等.膈下逐瘀湯加減方對人肝癌細胞端粒酶的影響［J］.中西醫結合肝病雜志，2008，18(5):292 -293.

［6］黃廷榮，周虹，費新應，等.膈下逐瘀湯加減方對人肝癌細胞bax、bcl-2、P53基因表達調控的影響［J］.中西醫結合肝病雜志，2008，18(6):355 -356，366.

［7］王建鋼，費新應，宋青.蛋白質組學研究技術在肝細胞癌診療中的應用［J］.臨床肝膽病雜志，30(9):958 -960.

［8］郭宏.基于蛋白質作用靶點篩選的中藥新藥研究評析［J］.中華中醫藥雜志，2011，26(3):423 -426.

［9］Ren F，Wu H，Lei Y，et al.Quantitative proteomics identification of phosphoglycerate mutase 1 as a novel therapeutic target in hepatocellular carcinoma［J］.Mol Cancer，2010，19(9):81.

［10］甘淋，李娟，郭坤，等.Stathmin 對肝癌細胞HCCLM3 增殖及其腫瘤相關基因表達的影響［J］.中華肝臟病雜志，2011，19(8):571-576.

［11］楊靜嫻.原肌球蛋白的分子生物學研究進展［J］.大連醫科大學學報，2004，26(2):145 -147.

［12］李明娜，張煒明，曹海龍，等.原肌球蛋白1 在非小細胞肺癌中的表達及意義［J］.江蘇醫藥，2010，36(18):2133 -2136.

［13］張軼，劉文韜，李強，等.腫瘤轉移相關基因原肌球蛋白的克隆及功能初步研究［J］.中華腫瘤雜志，2007，29(9):644 -648.

［14］Raval GN，Bharadwaj S，Levine EA，et al.Loss of expression of tropomyosin-1，a novel class II tumor suppressor that induces anoikis，in primary breast tumors［J］.Oncogene，2003，22(40):6194 -6203.

［15］胡秀娟.HSP90 在腫瘤中的研究［J］.醫學綜述，2008，14(1):67-69.

［16］趙鑫.腫瘤治療分子靶點HSP90 研究進展［J］.國外醫學·腫瘤學分冊，2004，31(8):594 -596.

［17］陳寧.高、低轉移肝細胞癌細胞株的定量蛋白質組研究［D］.北京:軍事醫學科學院，2008.

［18］周寧.酒精性肝病發生發展的基因組學和蛋白質組學研究［D］.杭州:浙江大學，2013:78.