高效液相色譜法比較巴西桑葉與中國桑葉中蘆丁含量

艾則孜江·艾爾肯 田志浩 李莉 徐文英 高山山 韓麗 趙百孝劉春生 馬長華

·巴西草藥研究專題·

高效液相色譜法比較巴西桑葉與中國桑葉中蘆丁含量

艾則孜江·艾爾肯 田志浩 李莉 徐文英 高山山 韓麗 趙百孝劉春生 馬長華

目的 通過研究不同產(chǎn)地桑葉中蘆丁含量,為桑葉資源的開發(fā)、利用提供初步的基礎(chǔ)。方法 采用HPLC法分別對11份不同產(chǎn)地藥材樣品的蘆丁含量進(jìn)行測定。高效液相色譜法條件為TechMate C18(4.6 mm×250 mm,5μm,NO.AKAD06833),以甲醇-0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,檢測波長為358 nm,柱溫為30℃。結(jié)果 8份國產(chǎn)樣品的蘆丁含量均未能達(dá)到《中華人民共和國藥典》(一部)(2010年版)的含量標(biāo)準(zhǔn),3份巴西樣品高于《中華人民共和國藥典》(一部) (2010年版)要求。結(jié)論 國內(nèi)桑葉中蘆丁含量普遍較低,巴西黑桑葉中蘆丁含量較高。

桑葉; 蘆丁; 含量測定

桑葉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,為桑科植物桑Morus alba L.的干燥葉,中國大部分地區(qū)均有栽培,尤以長江中下游及四川盆地為主。市場上也以此產(chǎn)地為主。桑葉性甘,苦寒,歸肺、肝經(jīng),具有疏散風(fēng)熱,清肺潤燥,清肝明目的作用,用于風(fēng)熱感冒,肺熱燥咳,頭暈頭痛,目赤昏花等癥,《神農(nóng)本草經(jīng)》稱其為“神仙葉”[1-2]。桑葉中的有效成分主要包括黃酮類、生物堿類、苯丙素類、有機(jī)酸類、甾體及三萜類等多種化合物[3],其中黃酮類化合物是桑葉的重要活性成分之一。新疆桑葉(Mulberry Leaves)異名鐵扇子,為桑科(Moraceae)植物桑Morus alba L.的樹葉,產(chǎn)于新疆阿克蘇、和田和喀什等地區(qū)古老的樹種,其葉具有補(bǔ)血鎮(zhèn)靜等功效,是新疆獨(dú)一無二的特殊稀貴資源,具有很高的藥用價(jià)值。現(xiàn)代藥理研究表明,桑葉具有降糖降脂[4-5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[7]等多種活性作用。巴西擁有較豐富的桑樹資源,栽培品種主要為白桑,主要集中在巴拉那州的馬林加等北部縣。為了更好地了解目前市場上的桑葉藥材質(zhì)量情況及擴(kuò)大桑葉藥用資源,依照2010版《中華人民共和國藥典》(一部),筆者對巴西桑葉和中國桑葉中的蘆丁進(jìn)行了含量測定。

1 材料與儀器

Waters 1525高效液相色譜儀(配置:泵Waters1525、檢測器 Waters 2998、自動(dòng)進(jìn)樣器2707),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYEL-A,N-1001),真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司),KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美),水浴鍋SHW.W-600(東方精銳),SchneiderMETTLER AE 240電子分析天平,SchneiderSARTFORUIS AG BS電子分析天平;無水乙醇(分析純,北京化工廠),甲醇(色譜純Fisher),水(去離子水);巴西桑葉(馬林加、隆德里納和烏木阿拉瑪)、新疆桑葉(新疆和田市、英阿瓦提、洛普縣和墨玉縣)、同仁堂桑葉(浙江、江蘇和四川)和自采桑葉(北京中醫(yī)藥大學(xué)東校區(qū),初霜后采集,60℃烘干),所有藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為桑科植物桑Morus alba L.。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的制備

取蘆丁對照品適量,精密稱定,用甲醇制成每1 mL含0.Lmg的溶液,作為母液備用。

2.2 供試樣品溶液的制備

取桑葉粉末(過三號篩)約1 g,精密稱定,置圓底燒瓶中,加甲醇50 mL,加熱回流30分鐘,濾過,濾渣再用甲醇50 mL,同法提取2次,合并濾液,減壓回收溶劑,殘?jiān)眉状既芙?轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 色譜條件

色譜柱:TechMate C18(4.6mm×250mm,5μm, NO.AKAD06833);流動(dòng)相:以甲醇為流動(dòng)相A,以0.5%的磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表1進(jìn)行梯度洗脫;流速:1 mL/min;檢測波長:358 nm;柱溫:24℃,見表1,色譜圖見圖1。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 取0.10 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣2μL、5μL、7.5μL、10μL、12.5μL、 20μL測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得蘆丁回歸方程:Y=2.0E+9X-1.3E+5,R2=0.9994。結(jié)果蘆丁在0.02 mg～0.20 mg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取0.10 mg/mL的蘆丁對照品溶液分別進(jìn)樣6針,每針12.5μL,以峰面積為指標(biāo)計(jì)算精密度,得蘆丁RSD=1.17%,表明精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取樣品2.0 g,按上述工藝提取,得供試品溶液,分別在0小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、6小時(shí)、8小時(shí)、10小時(shí)進(jìn)樣。以峰面積為指標(biāo)計(jì)算穩(wěn)定性,蘆丁RSD=1.28%,表明蘆丁在10小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取樣品2.0 g,按上述提取工藝提取,得供試品溶液,分別進(jìn)樣6針,每針10μL,以峰面積為指標(biāo)計(jì)算重復(fù)性,蘆丁RSD=0.92%,表明重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取藥材粉末6份(約1 g),加入蘆丁0.40 mg。按2010版《中華人民共和國藥典》(一部)方法操作。以峰面積為指標(biāo)計(jì)算加樣回收率。蘆丁RSD=0.79%,加樣回收率平均為100.97%,表明加樣回收率良好。

2.5 樣品測定及分析

分別取巴西桑葉、新疆桑葉、同仁堂桑葉和自采桑葉,按“2.2”項(xiàng)下方法對藥材進(jìn)行處理,按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件對制得的藥材供試樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行測定,并分析計(jì)算供試樣品蘆丁含量。各產(chǎn)地樣品測定結(jié)果見表2,以蘆丁為指標(biāo)巴西桑葉中蘆丁含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國內(nèi)桑葉,且高于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定,本研究收集的國內(nèi)桑葉蘆丁含量均低于藥典規(guī)定的0.1%,其中國內(nèi)桑葉中新疆黑桑蘆丁含量最低。見表3。

3 討論

通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)國內(nèi)市售桑葉藥材中蘆丁含量普遍偏低,并且低于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定,而巴西桑葉高于2010版《中華人民共和國藥典》(一部)規(guī)定,究其原因可能是由于采收季節(jié)不同。桑葉采收季節(jié)按照傳統(tǒng)用藥習(xí)慣確定,以霜桑葉為最佳。《中華人民共和國藥典》(一部)也規(guī)定桑葉要初霜后采收。楊普香等[9]的研究表明,9月底以后,桑葉中黃酮類化合物含量一直上升,霜后總黃酮含量,約為春夏秋桑葉的2倍,這為初霜后采收桑葉提供了科學(xué)依據(jù)。但是孟磊等[10]對新疆地區(qū)的桑葉中總黃酮含量進(jìn)行測定,結(jié)果表明新疆地區(qū)的桑葉霜前(9月)總黃酮含量高于霜后,這可能與新疆地區(qū)特殊的生態(tài)環(huán)境有關(guān)。中國桑資源豐富,全國各地都有栽培,現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的采收季節(jié)是否普遍適用,還需要做進(jìn)一步的考察。單一質(zhì)量控制指標(biāo)不能全面地代替藥材的療效,桑葉中含有生物堿、多糖、黃酮、酚類等多種化合物,具有不同的藥理活性,用單一成分測定的方法來對藥材進(jìn)行質(zhì)量控制,合理性有待商榷。中藥指紋圖譜不失為一種控制中藥質(zhì)量的有效方法之一。目前,英國、印度以及世界衛(wèi)生組織等都采用指紋圖譜技術(shù)對植物藥、草藥質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)[11]。有關(guān)桑葉指紋圖譜的研究還處于探索階段,有待進(jìn)一步研究。

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[2] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(下冊)[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1985:1963.

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Comparison of rutin between Brazilian and Chinesemulberry leaf by HPLC

Aizezijiang Ai-er-ken,TIAN Zhi-hao,LILi,et al. School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China

MAChang-hua,E-mail:machanghua60@sina.com

Objective Decete the content of rutin in mulberry leaves from different origins by HPLC and analyze the discrepancy for the development and utilization of mulberry leaves provide a preliminary basis.M ethods 11 kinds of mulberry leaves samples from domestic and foreign were detected.HPLC conditions,C18TechMate(4.6 mm×250mm,5μm,NO.AKAD06833)was used for detection.The gradient elution was carried out with methanol-0.5%phosphoric acid solution as mobile phase,the detection wavelength was358 nm,and the column temperaturewas30℃.Results The content of rutin in 8 kinds of domestic sampleswas failed to achieve the standard of Chinese Pharmacopoeia(2010 edition),the Brazilian samples were higher than the requirements of pharmacopoeia.Conclusion The content of rutin in domesticmulberry leaves is lower than that in Brazilianmulberry leaves,and the content in the Brazil black mulberry leaves is themost

Mulberry leaves; Rutin; Content determination

R284

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.001

2015-08-22)

(本文編輯:董歷華)

國家國際科技合作專項(xiàng)(2011DFA31370)

100102 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(田志浩(博士研究生)、李莉(碩士研究生)、徐文英(碩士研究生)、高山山(碩士研究生)、劉春生、馬長華),針灸推拿學(xué)院(趙百孝),中醫(yī)養(yǎng)生研究所(韓麗);新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部(艾則孜江·艾爾肯)

艾則孜江·艾爾肯(1986-),碩士。研究方向:藥品質(zhì)量控制。E-mail:aizi1009@sina.com

馬長華(1960-),本科,教授,碩士生導(dǎo)師。研究方向:藥品質(zhì)量控制。E-mail:machanghua60@sina.com