清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠內毒素及D-乳酸表達的影響

曹吳冰 高連印 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

·論著·

清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠內毒素及D-乳酸表達的影響

曹吳冰 高連印 車念聰 張秋云 杜宇瓊 付修文 王融冰 羅佳佳

目的 觀察清毒湯對實驗性重癥肝損傷大鼠丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、內毒素、凝血酶原活動度(prothrombin activity,PTA)及D-乳酸表達的影響,探討該方治療慢性重型肝炎內毒素血癥的作用機制。方法 建立TAA致實驗性大鼠重癥肝損傷模型,清毒湯干預后,檢測大鼠ALT、內毒素、PTA及D-乳酸的表達水平。結果 與正常組比較,模型組大鼠ALT、內毒素、D-乳酸水平均顯著升高(P＜0.01),PTA水平顯著下降(P＜0.01);與模型組比較,清毒湯低、中劑量組及乳果糖組血清ALT、內毒素、PTA及D-乳酸表達水平均有不同程度的改善(P＜0.05),清毒湯高劑量組除血清內毒素含量外各指標均明顯改善(P＜0.05);與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組除PTA外各指標均不同程度降低(P＜0.05),低劑量組各指標均無明顯差異(P＞0.05),高劑量組除PTA外各指標明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。結論 清毒湯對實驗性肝損傷大鼠有較好的改善肝損傷和降低內毒素表達的作用,尤其中劑量組最為明顯,推測其作用機制可能與降低腸道通透性相關。

肝損傷; 內毒素; 硫代乙酰胺; 凝血酶原活動度; D-乳酸

慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)是由多種因素引起嚴重的肝臟損害,其具有起病急、病情重、進展快、并發癥多等特點,其病死率約為50% ～90%[1-2]。研究表明,慢性重型肝炎可引起腸道通透性增加,誘發腸源性內毒素血癥,其發生率高達100%[3]。清毒湯是國家級名老中醫王融冰治療肝病腸源性內毒素癥的經驗方,前期研究證實清毒湯臨床治療本癥安全有效,本研究擬建立硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)致實驗性大鼠重癥肝損傷模型,通過觀察清毒湯對模型大鼠丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)、內毒素、凝血酶原活動度(prothrombin activity,PTA)及D-乳酸的影響,進一步研究清毒湯通過降低腸道通透性治療肝損傷的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠60只,雌雄各半,體質量180～200 g,清潔級,動物許可證號:SCXK(京) 2012-0001,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,飼養于首都醫科大學動物實驗科學部SPF級動物室,實驗期間,動物自由攝食、飲水,各組大鼠均喂普通飼料。

1.2 藥物與試劑

清毒湯組成:大黃10 g、枳實10 g、厚樸10 g、生地黃12 g、茜草9 g,上述藥物購自北京同仁堂,由首都醫科大學動物室煎制,制備成生藥含量1.5 g/mL的水煎劑,4℃冰箱保存備用。乳果糖購自北京科奧科技有限公司,生產批號:ka0009454;硫代乙酰胺購自北京科奧科技有限公司,生產批號:S0646;凝血酶試劑盒購自美國貝克曼公司;內毒素試劑盒購自南京建成生物工程研究所;D-乳酸試劑盒購自BioAssay Systems(美國博士公司)。

1.3 主要儀器

凝血分析儀(ACL-TOP700,美國貝克曼公司), Multiskan MK3酶標儀(Thermo Fisher Scientific公司),日立7600生化儀。

1.4 造模分組及給藥

大鼠適應性喂養1周后,隨機分為正常組和造模組。前8周造模組給予12 mg/kg的TAA灌胃。第9周開始,將TAA劑量調整為36 mg/kg。同時,將造模組隨機分為模型組、乳果糖組、清毒湯(高、中、低劑量)組。各中藥組每天1次灌服清毒湯濃縮液,劑量為11.9 g/kg、5.95 g/kg、2.98 g/kg。乳果糖組每天1次灌服3.5 mL/kg乳果糖。正常組和模型組給以同等容積的生理鹽水灌服作為對照。所有組連續給藥至第12周。

1.5 標本制備

第12周末,大鼠禁食12小時后,用10%水合氯醛按3.5 mL/100 g體質量腹腔注射麻醉,仰臥位固定,打開腹腔,觀察肝臟的色、質、形態和體積。于腹主動脈無菌取血,3 mL注射于抗凝管,2小時內送檢;剩余血注射于無菌真空采血管,3000 rmp離心10分鐘后,取上清分裝,-80℃保存備用。取部分肝置入4%多聚甲醛和電鏡液中,置-4℃冰箱保存。

1.6 指標檢測

ALT采用全自動生化檢測儀檢測,凝血酶原活動度采用全自動凝血儀檢測,內毒素采用酶聯免疫吸附法檢測,D-乳酸采用比色法檢測,各項指標檢測均嚴格按照試劑盒說明執行。

1.7 統計學處理

采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理,實驗數據以均數±標準差(±s)表示。各指標經正態檢驗,符合正態分布,組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA);ALT、PTA、D-乳酸組間方差不齊,采用Tamhane's T2檢驗;內毒素組間方差齊性,采用LSD檢驗。各種檢驗的顯著性水平均設定為P＜0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠肝功能血清學結果

與正常組比較,模型組大鼠血清ALT活性濃度顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠血清ALT活性濃度均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組 ALT明顯下降(P＜0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組ALT明顯下降(P＜0.05),清毒湯低劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)。清毒湯高劑量組ALT顯著高于乳果糖組(P＜0.01)。提示清毒湯具有降低實驗性肝損傷大鼠血清ALT活性濃度的作用,其中中劑量組效果比乳果糖組更明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當,高劑量組效果比乳果糖組較差。結果見表1。

表1 各組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶活性濃度的比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05,eP＜0.01。

組別 n ALT(U/L)正常組40.20±7.68模型組 8 135.75±4.56a乳果糖組 8 68.05±8.77c清毒湯低劑量組 8 77.85±10.65c清毒湯中劑量組 8 52.76±8.47cd清毒湯高劑量組 8 102.40±33.6 8 be

2.2 各組大鼠血清內毒素含量結果

與正常組比較,模型組大鼠血清內毒素含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠血清內毒素含量均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組內毒素含量顯著下降(P＜0.01),低劑量組差異無統計學意義(P＞0.05),高劑量組內毒素含量明顯高于乳果糖組(P＜0.05)。提示大鼠實驗性肝損傷內毒素血癥模型造模成功,清毒湯具有降低實驗性肝損傷大鼠血清內毒素含量的作用,其中中劑量組效果最明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中內毒素含量比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.01;與乳果糖組比較:cP＜0.05,dP＜0.01。

組別 n 內毒素(EU/L)正常組70.01±13.41模型組 8 109.33±12.44a乳果糖組 8 92.33±4.56b清毒湯低劑量組 8 92.87±4.63b清毒湯中劑量組 8 76.93±7.58bd清毒湯高劑量組 8 101.87±1.69 8 c

2.3 各組大鼠凝血酶原活動度結果

與正常組比較,模型組大鼠 PTA顯著下降(P＜0.01);與模型組比較,清毒湯高劑量組及乳果糖組明顯升高(P＜0.05),清毒湯低、中劑量組大鼠PTA顯著升高(P＜0.01)。與乳果糖組比較,清毒湯各組PTA差異無統計學意義(P＞0.05)。提示清毒湯具有提高實驗性肝損傷大鼠PTA的作用。結果見表3。

表3 各組大鼠凝血酶原活動度比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05。

組別 n PTA(%)正常組124.29±7.78模型組 7 36.57±8.40a乳果糖組 7 62.43±14.22b清毒湯低劑量組 7 79.29±13.11c清毒湯中劑量組 7 94.14±23.91c清毒湯高劑量組 7 60.43±11.79 7 b

2.4 各組大鼠血清D-乳酸含量結果

與正常組比較,模型組大鼠血清D-乳酸含量顯著升高(P＜0.01);與模型組比較,乳果糖組及清毒湯低、中劑量組大鼠 D-乳酸含量均顯著下降(P＜0.01),清毒湯高劑量組D-乳酸含量明顯下降(P＜0.05)。與乳果糖組比較,清毒湯中劑量組D-乳酸含量明顯下降(P＜0.05),清毒湯低劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)。清毒湯高劑量組D-乳酸顯著高于乳果糖組(P＜0.01)。提示清毒湯具有降低實驗性肝損傷大鼠血清D-乳酸含量的作用,其中中劑量組效果比乳果糖組更明顯,低劑量組效果與乳果糖組相當,高劑量組效果比乳果糖組較差。結果見表4。

表4 各組大鼠血清中D-乳酸含量比較(±s)

注:與正常組比較:aP＜0.01;與模型組比較:bP＜0.05,cP＜0.01;與乳果糖組比較:dP＜0.05,eP＜0.01。

組別 n D-乳酸(Mm/L)正常組0.41±0.14模型組 8 1.65±0.31a乳果糖組 8 0.73±0.07c清毒湯低劑量組 8 0.79±0.15c清毒湯中劑量組 8 0.60±0.06cd清毒湯高劑量組 8 1.14±0.14 8 be

3 討論

研究表明,腸源性內毒素是慢性重型肝炎發生和病情加重的重要因素[4]。肝組織損傷后產生大量炎性因子作用于腸道,一方面引起腸道菌群失調,另一方面損傷腸道黏膜屏障,造成大量內毒素由門靜脈進入肝臟[5],這些內毒素進一步刺激加重肝損傷。因此,修復腸道黏膜屏障,減少內毒素進入是阻斷疾病進展的關鍵環節。

D-乳酸是胃腸道固有細菌代謝、裂解的產物,正常情況下很少能被吸收,體內亦沒有快速降解的酶系統。當腸道細菌過度生長時可產生大量的D-乳酸,在腸黏膜通透性增加時進入血循環,使血中D-乳酸水平升高。因此監測其水平可及時反映腸黏膜損傷狀況及腸黏膜通透性[6]。研究表明[7],乳果糖能通過降低腸道通透性,保護腸黏膜功能,從而明顯地降低血清內毒素水平,對肝硬化的治療具有較好的療效[8]。

根據慢性重型肝炎內毒素血癥臨床表現,當隸屬于中醫學“疫毒”“疫黃”“臌脹”“黃疸”等病癥的范疇。國家級名老中醫王融冰教授認為慢性重型肝炎內毒素血癥的病位在肝及腸絡,病機乃因虛致實,虛者肝體受損,多臟俱虛,實者乃毒瘀膠著,毒損腸絡,據此提出“通腸治肝”的方法,并創制了清毒湯。清毒湯由《傷寒論》中的小承氣湯化裁而來,其中大黃、枳實、厚樸清熱解毒、通腑攻下,生地黃、茜草滋陰涼血。該方通過通腑攻下以降低腸道通透性,抑制內毒素的產生,從而阻斷內毒素對肝臟的第二次打擊,降低肝損傷。

本實驗結果顯示,模型組大鼠血清ALT、內毒素、D-乳酸水平較正常組顯著提高,PTA顯著下降。經清毒湯治療后,ALT、內毒素、D-乳酸均明顯下降, PTA明顯升高,尤其清毒湯中劑量組效果顯著。提示清毒湯對TAA致實驗性肝損傷大鼠具有保護肝臟,改善肝功能,減少血清中內毒素以及D-乳酸含量的作用。推測其機制是通過降低腸道通透性減少內毒素及D-乳酸入血,達到保護肝臟的作用,但是清毒湯從腸治肝的機制有待進一步探究。

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Effects of Qingdu decoction on endotoxin and D-lactic acid exp ressions in the ratsw ith experimentalsevere liver injury

CAO Wu-bing,GAO Lian-yin,CHE Nian-cong,et al.Capital Medical University School of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100069,China

GAO Lian-yin,E-mail:gly066@sina.com

Objective To observe the effects of Qingdu decoction on the expressions of alanine aminotransferase(ALT),endotoxin,prothrombin activity(PTA)and D-lactic acid in ratswith severe liver injury and explore themechanism of Qingdu decoction on treating Chronic severe hepatitis complicated with endotoxemia.M ethods The severe liver injury rat model was induced by Thioacetamide(TAA),and treated with Qingdu decoction.And then the blood level of ALT,endotoxin,PTA and D-lactic acid were measured.Results The expression levels of ALT,endotoxin and D-lactic acid in the model group were significantly increased and PTA was significantly decreased compared to that of in the Normal Group (P＜0.01).Compared to themodel group,the level of ALT,endotoxin,PTA and D-lactic acid inmiddle and low dose Qingdu decoction groups and Lactulose group were improved significantly(P＜0.05).All indexes expressions except endotoxin in the high dose Qingdu decoction group were decreased significantly (P＜0.05).Compared to the Lactulose group,all indexes expressions except PTA in them iddle doseQingdu decoction group were decreased significantly(P＜0.05).All indexes in the low dose group had no significant difference(P＞0.05),while all indexes expressions except PTA in the high dose group were significantly higher than the Lactulose group(P＜0.05).Conclusion Qingdu decoction can improve liver injury and decrease endotoxin in rats with experimental hepatic injury complicated with endotoxemia, especially in themiddle dose group.Themechanism could be related to the reduction of intestinal permeability.

Liver injury; Endotoxin; Thioacetamide; Prothrombin activity; D-lactic acid

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.015

2015-04-13)

(本文編輯:董歷華)

北京市自然科學基金(7142023);北京市教委課題(KM2011100025206)

100069 北京,首都醫科大學中醫藥學院[曹吳冰(碩士研究生)、高連印、車念聰、張秋云、杜宇瓊、羅佳佳(碩士研究生)];首都醫科大學校醫院內科(付修文);首都醫科大學附屬北京地壇醫院中西醫結合科(王融冰);中醫絡病研究北京市重點實驗室(曹吳冰、高連印、車念聰、張秋云、杜宇瓊、羅佳佳)

曹吳冰(1990-),女,2013級在讀碩士研究生。研究方向:中醫藥防治慢性肝病內毒素血癥機制研究。E-mail:xk.bangbang@163.com

高連印(1966-),女,博士,碩士生導師。研究方向:中醫藥防治慢性肝病機制研究。E-mail: gly066@sina.com