活血解毒中藥組分配伍對急性心肌梗死后缺血心肌病理形態和心功能的影響

董國菊 劉劍剛 張慶翔 張蕾 張大武

·論著·

活血解毒中藥組分配伍對急性心肌梗死后缺血心肌病理形態和心功能的影響

董國菊 劉劍剛 張慶翔 張蕾 張大武

目的 探討活血解毒中藥(赤芍總苷、黃連生物堿)組分配伍對實驗性急性心肌梗死大鼠早期心室重構的缺血心肌病理形態及心功能的影響。方法 實驗用健康Wistar大鼠,雄性,體質量180～200 g,水合氯醛腹腔麻醉,結扎冠狀動脈左前降支造成急性心肌梗死模型,手術成活大鼠隨機分為模型組、中藥活血組(赤芍總苷)、中藥解毒組(黃連生物堿)、活血解毒組(赤芍總苷+黃連生物堿)、辛伐他汀組共5組,每組10只,術后連續給藥14天。另設假手術組(結扎線穿過冠狀動脈左前降支,不接扎)10只,和模型組給予等量蒸餾水。末次給藥后空腹16小時,然后麻醉做心臟超聲多普勒檢測,結束后腹主動脈取血,放射免疫方法檢測血清中的白細胞介素-1β,腫瘤壞死因子-α和高敏C-反應蛋白的炎癥水平,心肌組織分別取材處理,光鏡和電鏡觀察心肌組織的結構變化。結果 和模型組比較,赤芍總苷組、黃連生物堿組和活血解毒組分配伍對大鼠血清白細胞介素-1β,腫瘤壞死因子-α和高敏C-反應蛋白含量均有顯著抑制作用(P＜0.05,P＜0.01),赤芍總苷組和活血解毒組治療的心肌細胞形態較為整齊,炎癥細胞浸潤明顯減少,心肌線粒體結構較為完整;和模型組比較,活血解毒組大鼠的左心室面積顯著縮小(P＜0.05),心臟超聲顯示的左室舒張末內徑和收縮末內徑減少(P＜0.05),左室射血分數顯著提高(P＜0.05)。結論 赤芍總苷和黃連生物堿配伍具有一定的綜合優勢。活血解毒組配伍能夠干預急性心肌梗死后早期心室重構,抑制血清炎癥水平,保護缺血心肌細胞,促進心臟功能的恢復。

急性心肌梗死; 心室重構; 赤芍總苷; 黃連生物堿; 活血解毒; 組分配伍

急性心肌梗死(acute myocardial infarction, AMI)后由于心肌細胞的缺血缺氧壞死而引起的心臟結構和功能發生病理生理的變化導致心室重構,主要表現為梗死區的心肌變薄、擴張,非梗死區心肌代償性節段變長,左室逐漸呈球形擴張[1]。心室重構(ventricular remodeling,VR)是AMI后心力衰竭的主要病理因素,是心血管領域長期以來研究的焦點。隨著冠心病二級預防的規范與普及,AMI后VR的進程得到了有效的延緩,但AMI后心力衰竭仍然是影響患者生存質量和生命的主要病因[2-3]。動脈粥樣硬化是冠心病的發病基礎,眾多研究表明,在動脈粥樣硬化發生與發展中,炎癥因子起著非常重要的作用,也是AMI后心力衰竭血清標志物的檢測指標,對AMI后心力衰竭患者的發展和預后起著重要的作用[4-5]。按照指南常規治療[6]的基礎上進行中醫藥的干預,能在一定程度上延緩甚至逆轉VR的進程,中西醫結合聯合用藥可保護AMI后心臟結構和功能,進一步提高AMI患者的生存質量和遠期存活率[7]。根據中醫AMI急性期“瘀毒”互結致病學說的認識,本課題組結合前期研究發現,活血解毒中藥有效組分對AMI后早期VR的炎癥水平具有抑制作用,并能改善AMI后VR[8],本研究在前期研究的基礎上,進一步觀察活血解毒藥組分配伍對AMI后早期VR的病理形態、超微結構和心功能的影響,為臨床應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物和試劑

赤芍提取物(采用70%乙醇的水溶液回流提取,主要成分赤芍總苷),2.50 g生藥/g,由陜西西安開來生物工程有限公司提供;黃連提取物(采用醇回流提取法,主要成分黃連生物堿),6.25 g生藥/g,由北京同仁堂制藥有限公司提供;辛伐他汀片,20 mg/片,杭州默沙東制藥有限公司提供,批號:120973。白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)放射免疫試劑盒,批號:20120824;腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)放射免疫試劑盒,批號:20120825;高敏 C-反應蛋白(hypersensitive C-reactive protein, hs-CRP)放射免疫試劑盒,批號:20120828;均由北京華英生物技術研究所提供。

1.2 實驗動物

清潔級,雄性,Wistar大鼠120只,體質量180～200 g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,合格證號:SCXK(京)2009-0007。動物飼養在清潔級動物室,普通飼料喂食,自由攝水,大鼠適應性飼養7天后進行實驗。光照和通風條件均符合國家和行業規定的標準。

1.3 急性心肌梗死動物模型的建立

大鼠空腹12小時,不限制飲水。第2天,用4% 水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉(9 mL/kg體質量),動物進入麻醉狀態后,胸部脫毛備皮,常規消毒后將其固定于動物手術臺上。確定大鼠心臟的大致位置剪開皮膚,快速逐層分離胸部組織,鈍性分離3～4肋間暴露心臟,快速擠出心臟,帶線縫合針穿行大鼠左冠狀動脈前降支處結扎動脈血管,穩定2分鐘,用ECG-6511心電圖機記錄Ⅱ導聯心電圖,以心電圖出現T波段弓背樣抬高(和)或T波高聳,肉眼觀察缺血心肌呈暗紅色為結扎成功。逐層縫合胸腔,術后肌肉注射青霉素鈉20萬U/d,連續3天預防感染。假手術組手術方式一樣,但在心臟血管處僅穿線不結扎。造模后24小時存活的大鼠進入實驗分組。動物實驗過程中嚴格遵守《北京市實驗動物福利倫理審查指南》及動物倫理學的要求。

1.4 實驗分組及給藥

大鼠預先給藥7天,造模成功后的大鼠隨機分為6組,每組10只。(1)空白對照(假手術)組:每日灌胃等量蒸餾水;(2)AMI(模型)組:每日灌胃等量蒸餾水;(3)陽性藥物對照(辛伐他汀)組:每日灌胃辛伐他汀184 mg/kg;(4)活血藥(赤芍總苷)組:每日灌胃赤芍總苷54 mg/kg;(5)解毒藥(黃連生物堿)組:每日灌胃黃連生物堿54 mg/kg;(6)活血解毒藥(赤芍總苷+黃連生物堿)組,每日灌胃黃連生物堿54 mg/kg+赤芍總苷54 mg/kg。各組均連續灌胃14天,藥物用蒸餾水稀釋至所需濃度灌胃給藥。

1.5 動物指標檢測和病理取材

第14天喂藥后,禁食12小時,不禁水。第15天, 4%水合氯醛水溶液腹腔注射麻醉(0.1 mL/kg BW),胸部備皮,仰臥固定四肢,做心臟超聲多普勒(型號:HDI 5000,高頻線陣(7-15MHZ)探頭,飛利浦(中國)投資有限公司)檢測左室收縮末期內徑(1eft ventricular end-systole dimension,LVEDs)、左室舒張末期內徑(left ventricular end-diastole dimension, LVEDd)、左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)。測定3個心動周期的平均值,操作由本醫院熟練的專科醫師完成。

檢測完成后,大鼠腹主動脈取血,分離血清-80℃保存,統一測定各組的血清炎癥(型號:r-911,全自動放射免疫γ計數器,中國科技大學實業總公司)指標。然后取大鼠的心肌組織,濾紙陰干后,分離缺血的心肌組織,一部分10% 中性甲醛溶液固定,用于普通病理觀察,另一部分,用2.5%的戊二醛磷酸緩沖液固定,用于超微結構的觀察。

1.6 心肌組織病理觀察

10%中性甲醛溶液固定心臟標本,石蠟包埋完成固定,脫水,透明,浸蠟和包埋過程,進行石蠟的均勻切片,厚度約5μm,蘇木素-伊紅(hemotoxin and eosin,HE)染色,普通光鏡下觀察大鼠心肌組織的形態結構。2.5%的戊二醛固定的心肌組織,用l%鋨酸繼續固定。組織樣品經梯度酒精逐級脫水后,用Epon812環氧樹脂包埋,超薄切片機切片后,用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色,透射電鏡(H-600型,日本日立公司)觀察心肌細胞超微結構的差異。

1.7 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行數據處理。所有數據均采用均數±標準差(±s)表示,進行正態分布和方差齊性檢驗。符合正態分布且方差齊采用單因素方差分析(one-way ANOVA),進一步組間多重比較采用LSD法,不符合正態分布的用Wilcoxon秩和檢驗,P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 活血解毒中藥組分配伍對AMI后VR大鼠血清炎癥因子的影響

因放射免疫方法的靈敏度較高,AMI后大鼠的IL-1β,TNF-α含量差異較大,尤其模型組的個別數據不在正態分布,故采用Wilcoxon秩和檢驗進行統計。造模后第 14天,大鼠血清 IL-1β,TNF-α和hs-CRP含量明顯升高,和假手術組比較有顯著差異(P＜0.05,P＜0.05);和模型組比較,黃連生物堿組和赤芍總苷組對不同炎癥水平均有不同程度的降低,具有統計學差異(P＜0.05,P＜0.01),活血解毒組對大鼠血清IL-1β,TNF-α和hs-CRP含量均有顯著抑制作用,和模型組比較有顯著差異(P＜0.05, P＜0.01),兩組配伍在MCP-1和IL-1β指標上有進一步降低的趨勢,三組組間比較沒有顯著差異(P＞0.05)。結果見表1。

2.2 活血解毒中藥配伍對AMI后VR大鼠心臟形態結構的影響

急性心肌梗死后14天時,大鼠的心腔面積增大,心室壁變薄,對各組大鼠進行左心室腔面積/心臟面積的比值測定,其中假手術組大鼠的左心室腔約占心臟面積的5.67%,而模型組約占16.55%,兩組差異有統計學意義(P＜0.01);與模型組相比,各給藥組均在一定程度上減少左心室面積/心臟面積的比值,其中赤芍總苷組和活血解毒組具有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

表1 第14天時活血解毒中藥配伍對AMI大鼠血清炎癥水平的影響(±s,n=10)

注:與模型組比較,aP＜0.05,bP＜0.01

組別 劑量(mg/kg) hs-CRP(mg/L) TNF-α(μg/L) IL-1β(μg/L) 2.48±0.28 1.80±0.27 0.29±0.08模型組 — 3.74±0.40 1.95±0.43 0.61±0.10辛伐他汀組 184 2.77±0.50a1.40±0.30b0.29±0.06a黃連組 54 2.97±0.47a1.57±0.55a0.25±0.08b赤芍組 54 2.78±0.50a1.28±0.52b0.35±0.09a活血解毒組 108 2.67±0.38a1.32±0.37b0.25±0.09假手術組 —b

大鼠心肌組織的病理形態觀察,光學顯微鏡鏡下HE染色可見,造模14天后,模型組大鼠的心肌細胞排列紊亂,細胞形態模糊,出現廣泛融合性病變,心肌細胞局部呈波紋狀改變,肌纖維溶解液化,細胞核固縮,梗死區有片狀壞死,缺血區伴有炎癥浸潤,邊緣可見充血。而假手術組心肌穿刺處有少量炎癥浸潤,細胞受損,大部分心肌細胞排列整齊、致密而無變性,細胞核染清晰,可見少量成纖維細胞。各給藥組心肌細胞排列較為整齊,炎癥細胞浸潤明顯減少,成纖維細胞輕度增生,其中以活血解毒組改善較為明顯。見圖2。

表2 活血解毒中藥組分配伍對AMI后早期VR大鼠超聲心動圖指標的影響(±s)

注:與模型組比較,aP＜0.05,bP＜0.01

分組 劑量(mg/kg) LVEDd(mm) LVEDs(mm) EF(%) 3.18±0.77 0.89±0.21 91.90±14.42模型組 — 6.14±1.07a4.67±2.08a48.18±9.91a辛伐他丁組 184 5.49±1.16a3.34±1.14a52.40±7.90a赤芍總苷組 54 5.91±0.66a2.74±0.75a63.60±11.80b黃連生物堿組 54 5.06±1.04a4.08±1.46a55.70±13.90a活血解毒組 108 5.03±1.86a3.56±1.49a66.40±12.50假手術組 —b

2.3 活血解毒中藥配伍對AMI后大鼠心肌超微結構的影響

大鼠心肌細胞超微結構觀察,電子顯微鏡下可見,假手術組大鼠的心肌結構完整,細胞器結構清晰,線粒體沒有損傷和水腫。模型組心肌結構模糊,肌膜破損,肌原纖維排列紊亂,細胞器結構受損,可見線粒體有水腫,晶格狀包涵體形成,嵴斷裂,核膜皺縮。赤芍總苷組、黃連生物堿組和活血解毒組分配伍組不同程度減輕心肌細胞內水腫,核染色質有凝聚。活血解毒組分配伍組顯著,肌原纖維排列尚規則,肌小節較清楚,線粒體輕度腫脹,核固縮減輕,結果見圖3。

2.4 活血解毒中藥配伍對AMI后大鼠心臟功能的影響

造模2周后,除假手術組外,各組大鼠M型超聲心動圖均表現為不同程度的室壁節段性運動異常,梗死區室壁變薄,收縮運動幅度減低,以模型組為著。對大鼠同一周期LVEDs、LVEDd和LVEF進行測定,結果顯示:與假手術組相比,各組大鼠LVEDd和 LVEDs均增大,LVEF明顯降低(P＜0.05);與模型組相比,各用藥組LVEF均有不同程度的提高,其中以中藥赤芍總苷組和中藥活血解毒組效果為優(P＜0.01);與模型組相比,各用藥組LVEDd和LVEDs均有不同程度的減少,以黃連生物堿組和活血解毒組效果為著(P＜0.05),結果見表2。

3 討論

急性心肌梗死后心室重構是一個復雜的病理生理過程,涉及到神經內分泌激活、炎癥水平演變、膠原代謝重構和能量代謝改建等多個病理環節,其最終都是導致梗死區心肌細胞凋亡、心肌收縮力減退,心臟結構和功能出現異常,進而逐漸發展為心力衰竭。所以,如何有效逆轉AMI后VR一直是心血管領域的防治熱點。2013年歐洲心力衰竭指南在循證醫學基礎上,更加明確地確定了能夠逆轉VR的血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)/血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、β受體阻滯劑和醛固酮受體拮抗劑在心力衰竭中的應用地位[9]。但臨床實踐中,仍有許多不盡意之處,比如,慢性心力衰竭血壓偏低的患者ACEI和ARB的應用受到限制,心率偏慢或者合并哮喘的患者β受體阻滯劑應用受到制約,合并腎功能不全的患者應用醛固酮受體拮抗劑有增加高血鉀的風險,而且長期醛固酮受體拮抗劑的應用有類性激素樣作用。諸如此類的問題使得相當多的AMI后慢性心力衰竭的患者沒有得到充分的治療,所以慢性心力衰竭也一直是困擾患者和心內科醫生的主要慢性病。

AMI是冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂,導致血栓形成,相應的血管阻塞而致的心肌缺血壞死。在AMI的病理生理反應過程中,炎癥因子的激活、細胞因子的級聯反應與心肌缺血損傷程度存在一定程度相關性,而促炎細胞可加重心室重構的病理過程[10]。作為炎癥反應標志物的高敏C-反應蛋白、白細胞介素1在AMI后的早期水平的變化和心功能水平密切相關[11]。本研究結果表明,黃連生物堿和赤芍總苷對大鼠AMI后VR血清炎癥因子具有不同的抑制作用,而活血解毒組分配伍對大鼠血清炎癥因子IL-1β、TNF-α和hs-CRP含量均有顯著抑制作用。急性心肌梗死后導致心肌缺血,左心室壁收縮運動不協調,心室內壓力負荷加重,心肌細胞受到壓力導致室壁的生物應力增加,引起整個左心室擴張和心室結構形態變化,實驗結果顯示,活血解毒中藥配伍能保護缺血心肌的細胞結構和線粒體的形態,緩解早期的心室擴張。

中醫藥以其不良反應較少、多靶點綜合調控、辨證施治的優勢為慢性心力衰竭患者提供有效的治療方案。課題組早期提出冠心病“瘀毒致變”學說,認為在AMI急性期瘀毒交結,易傳變,易發生心血管事件。有學者觀察并對AMI患者的主要證侯分布進行了研究,發現2/3的患者有不同程度的瘀或者毒的證素存在,為活血解毒治療AMI提供了依據[12]。黃連作為清熱解毒的代表藥物,其主要成分黃連生物堿有抗心律失常、提高心肌收縮、降壓降脂、抑制炎癥水平等多重心臟保護作用[13],赤芍總苷的現代藥理研究亦證實其有抗凝血、抗血栓、改善微循環、保護心臟缺血等藥理作用[14]。黃連生物堿聯合赤芍總苷清熱解毒、活血化瘀,瘀毒并解,標本兼顧,不僅契合AMI的中醫病機特點,也符合其現代藥理研究結果。課題研究證實活血解毒(黃連生物堿+赤芍總苷)能抑制AMI后的血清炎癥水平,保護心肌細胞形態的完整性,減少心室腔面積的擴張,改善心臟的結構,具有保護心臟的功能,體現中藥組分配伍相互兼顧的優勢,同時中藥組分配伍達到成分內容清楚、作用靶點明確、作用環節機理相對清楚的水平。課題研究還應進一步延長藥物給藥周期、對肝腎功能監測和心肌組織炎癥含量進行測定,使中藥組分配伍方藥達到“安全穩定、有效可控”[15],為中醫藥在AMI后二級預防提供了藥理依據。

致謝:本課題研究動物心功能檢測由超聲室姚立芳主任醫師協助完成,謹致謝忱!

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The protective effects of com ponent compatibility of Huoxue and detoxification on ischem ic m yocardium and cardiac function after acutemyocardial infarction

DONGGuo-ju,LIU Jian-gang,ZHANGQing-xiang,et al.Xiyuan Hospital,China Academy ofChinese Medical Sciences;Institute ofCardiovascular Disease ofChina Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100091,China

DONGGuo-ju,E-mail:dongguoju@126.com

Objective To discuss the protective effects of component compatibility of total paeony glycoside(TPG)and alkaloids of rhizome(AR)on ischemic myocardium and cardiac function of ventricular remodeling(VR)rats after acute myocardial infarction(AMI).M ethods The Wistar rats were randomLy divided into 6 groups,including sham-operated group,model group,simvastatin group, TPG group,AR group,total TPG and AR group.Continuously administrated drugs for14 days.The shamoperated and model group were given the same dosage distilled water.16 hours after the last administration,anesthetized and detected the cardiac doppler ultrasound,the level of interleukin-1 beta (IL-1β),tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and hypersensitive C-reactive protein(hs-CRP).The pathological structural changes ofmyocardial tissuewere observed by lightmicroscope and electronmicroscope.Results Compared with the model group,the level of IL-1β,TNF-αand hs-CRP significantly decreased than those in TPG,AR and both TPG and AR group(P＜0.05,P＜0.01);The morphology of cardiac muscle cells andmitochondrion ismore regular and less inflammatory cells infiltration in TPG and both TPG and AR group;compared with the model group,the left ventricular area obviously reduced in the TPG, AR,simvastain and both TPG and AR group(P＜0.05);1eft ventricular end-systole dimension(LVEDs) and left ventricular end-diastole dimension(LVEDd)significantly decreased and left ventricular ejection fraction(LVEF)significantly increased in the TPG,AR,simvastain and both TPG and AR group (P＜0.05).Among them,the both TPG and AR group show greater advantages.Conclusions The component compatibility of TPG and AR could intervene the early VR after AMI,inhibit the inflammation factors,protect ischemic myocardium and promote the recovery of cardiac function.

Acute Myocardial Infarction; Ventricular Remodeling; Total paeony glycoside; Alkaloids of rhizome; Promoting Blood Circulation and Detoxification; Component Compatibility

R285;R542.22

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.017

2014-12-20)

(本文編輯:蒲曉田)

國家自然青年科學基金(81001517);國家自然科學基金面上項目(81273929);科技部國際科技合作與交流項目(2014DFG32700)

100091 北京,中國中醫科學院西苑醫院心血管病中心;中國中醫科學院心血管病研究所

董國菊(1975-),女,博士,副主任醫師。研究方向:中西醫結合心血管疾病基礎與臨床研究。E-mail:dongguoju@126.com