裸花紫珠提取物凝血有效部位的研究

張利 黃勝 顏小捷 楊子明 谷陟欣 李典鵬

·論著·

裸花紫珠提取物凝血有效部位的研究

張利 黃勝 顏小捷 楊子明 谷陟欣 李典鵬

目的 研究裸花紫珠提取物凝血作用及其有效部位。方法 以質控血漿為研究對象,通過測定裸花紫珠粗提物及各分離部位和單體對凝血酶原時間(prothrombin time,PT)、凝血酶時間(thrombin time,TT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)、血漿纖維蛋白原(fibrinogen,FIB)四項指標觀察其對凝血系統(tǒng)的影響。結果 與溶媒對照比較,裸花紫珠粗提物能明顯縮短PT、APTT、TT的時間,能明顯提高FIB含量;裸花紫珠40%甲醇洗脫部位能明顯縮短APTT、TT的時間,能明顯提高FIB含量;與粗提物比較,40%甲醇洗脫部位效果最接近于粗提物。結論 裸花紫珠有較好的凝血效果,其有效部位可能在40%甲醇洗脫部位。

裸花紫珠; 有效部位; 凝血; 凝血酶原時間

裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.為馬鞭草科紫珠屬植物,又名紫珠,主產于中國海南,是海南的一種道地藥材,在廣東、廣西也有分布[1]。國外主要分布于越南、印度和馬來西亞。其味苦、微辛,性平,根、莖、葉皆可入藥,有解毒、抗菌消炎、收斂止血、散瘀消腫之功效,主治急性傳染性肝炎、化膿性炎癥、呼吸道及消化道出血、血小板減少性紫癜等癥,外用主要用于治療燒傷、燙傷、風濕腫痛、跌打腫痛、外傷出血、肺結核咳血、胃腸出血等癥,是海南黎族醫(yī)生常用藥材之一[2-5]。目前對裸花紫珠凝血有效部位、凝血機制研究均較少,有學者報道裸花紫珠總黃酮是其凝血的主要有效成分[6]。為了探討裸花紫珠凝血活性的有效部位及凝血機理,本實驗對裸花紫珠凝血作用的主要活性部位進行了篩選研究,并初步探討了其凝血作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

裸花紫珠粗提干浸膏粉末(由九芝堂藥業(yè)海南分公司提供);質控血漿(北京世帝,生產批號:20130508)、凝血酶原時間(prothrombin time,PT)試劑盒、凝血酶時間(thrombin time,TT)試劑盒、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time,APTT)試劑盒、血漿纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)凝血酶原時間(prothrombin time,PT)試劑盒、均為北京世帝科學儀器公司生產;甲醇(西隴化工,生產批號:121013)、二甲基亞砜(國藥試劑,生產批號:110506)等試劑均為分析純。

1.2 實驗儀器

AT-200型電子天平(德國 METTLER公司), LG-PABER凝血因子分析儀(北京世帝),QD型高速離心機(珠海黑馬),R-200型旋轉蒸發(fā)儀(Buchi Labortechnik AG CH-9230),Agilent1100分析型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)。

1.3 有效部位和成分的提取分離

稱取500 g裸花紫珠粗提干浸膏粉末,按質量體積為比為1∶20用適量去離子水完全溶解后先經布袋過濾,后經棉花塞過濾;所得濾液上HP-20大孔樹脂,依次采用去離子水、5%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇洗脫,各梯度均洗脫至無顏色為止,得大孔樹脂未吸附部分、水洗脫部位、5%甲醇洗脫部位、40%甲醇洗脫部位、60%甲醇洗脫部位、80%甲醇洗脫部位;將上述各部分分別于旋轉蒸發(fā)儀50℃下減壓濃縮得水洗脫部分浸膏、5%甲醇洗脫部分浸膏、40%甲醇洗脫部分浸膏、60%甲醇洗脫部分浸膏、80%甲醇洗脫部分浸膏。經HPLC分析,大孔樹脂未吸附部位和5%甲醇洗脫部位均包含于水洗脫部位中,故將此三部分合并統(tǒng)稱為水洗部位。其中水洗脫部位回收率為66.02%,40%甲醇洗脫部位回收率為19.22%,60%甲醇洗脫部位回收率為 8.50%,80%甲醇洗脫部位回收率為3.50%。從裸花紫珠粗提干浸膏粉末分離得到連翹酯苷B、原兒茶酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷4個單體,其中連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷主要從40%甲醇洗脫部分得到。

1.4 裸花紫珠提取物對凝血系統(tǒng)的影響

將水洗部位、40%甲醇洗脫部位、60%甲醇洗脫部位、80%甲醇洗脫部位4個活性部位;連翹酯苷B、原兒茶酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷4個單體化合物分別溶于20%的二甲基亞砜溶液中,以20%的DMSO溶液為空白對照組,取質控血漿量與試驗藥物溶液體積比為9∶1,混勻。每種藥物重復實驗3次,求其平均值。嚴格按LG-PABER半自動血小板聚集凝血因子分析儀操作規(guī)程,依次測定各試驗藥物PT、TT、APTT、FIB這4項血凝指標。血漿PT縮短率(%)=(溶媒對照平均PT-給藥平均PT)/溶媒對照平均PT×100%;TT縮短率(%)=(溶媒對照平均TT-給藥平均TT)/溶媒對照平均TT×100%; APTT縮短率(%)=(溶媒對照平均APTT-給藥平均APTT)/溶媒對照平均APTT×100%;FIB提高率(%)=(給藥平均FIB含量-溶媒對照平均FIB含量)/溶媒對照平均FIB含量×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數據分析,實驗數據均以(±s)表示,兩個獨立樣本均數比較采用t檢驗,多個樣本之間的比較采用單因素方差分析,進一步兩兩比較采用LSD,P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 裸花紫珠提取物對PT的影響

與溶媒對照比較,粗提物組,水洗脫部位、80%甲醇洗脫部位2個部位,原兒茶酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷4個單體的凝血酶原時間(PT)均明顯縮短,有統(tǒng)計學意義;與粗提物(裸花紫珠粗提干浸膏粉末)比較,40%甲醇洗脫部位的PT明顯延長,有統(tǒng)計學意義。結果見表1。

表1 裸花紫珠提取物對PT的影響(±s,n=3)

注:與溶媒對照比較,aP＜0.05,bP＜0.01;與粗提物比較,cP＜0.01。

組別 劑量(g/mL) PT(s) 縮短率(%)溶媒對照 — 16.6±0.6—2.4粗提物 0.050 15.8±0.7a4.8水洗脫部位 0.033 15.3±0.1b7.8 40%甲醇洗脫部位 0.010 16.8±0.4c-1.2 60%甲醇洗脫部位 0.004 16.5±0.2 0.6 80%甲醇洗脫部位 0.002 15.8±0.3a4.8原兒茶酸 0.002 15.8±0.1a4.8連翹酯苷B 0.002 15.8±0.2a4.8異毛蕊花糖苷 0.002 15.9±0.2a4.2毛蕊花糖苷 0.002 15.5±0.6b

2.2 裸花紫珠提取物對TT的影響

與溶媒對照比較,粗提物,水洗脫部位、40%甲醇洗脫部位、60%甲醇洗脫部位3個部位,連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷3個單體的凝血酶時間(TT)均明顯縮短,有統(tǒng)計學意義;與粗提物比較, 4個活性部位及4個單體的TT明顯延長,有統(tǒng)計學意義,其中40%甲醇洗脫部位最接近于粗提物。結果見表2。

表2 裸花紫珠提取物對TT的影響(±s,n=3)

注:與溶媒對照比較,aP＜0.01;與粗提物比較,bP＜0.01,cP＜0.05。

組別 劑量(g/mL) TT(s) 縮短率(%)溶媒對照 — 14.1±0.2—5.0粗提物 0.050 11.8±0.3a16.3水洗脫部位 0.033 13.4±0.5ac5.0 40%甲醇洗脫部位 0.010 12.3±0.1ab12.8 60%甲醇洗脫部位 0.004 13.3±0.3ac5.7 80%甲醇洗脫部位 0.002 13.8±0.2c2.1原兒茶酸 0.002 13.9±0.1c1.4連翹酯苷B 0.002 13.3±0.3ac5.7異毛蕊花糖苷 0.002 13.2±0.4ac6.4毛蕊花糖苷 0.002 13.4±0.1ac

2.3 裸花紫珠提取物對APTT的影響

與溶媒對照比較,粗提物活化部分凝血活酶時間(APTT)明顯縮短,有統(tǒng)計學意義,水洗脫部位APTT明顯延長,有統(tǒng)計學意義;與粗提物比較,水洗脫部位、40%甲醇洗脫部位、80%甲醇洗脫部位3個部位,原兒茶酸、連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷4個單體APTT明顯延長,有統(tǒng)計學意義,其中40%甲醇洗脫部位、60%甲醇洗脫部位最接近于粗提物。結果見表3。

表3 裸花紫珠提取物對APTT的影響(±s,n=3)

注:與溶媒對照比較,aP＜0.01;與粗提物比較,bP＜0.05,cP＜0.01。

組別 劑量(g/mL)APPT(s) 縮短率(%)溶媒對照 — 39.4±1.6—-0.3粗提物 0.050 37.2±0.5a5.6水洗脫部位 0.033 45.0±0.8ac-14.2 40%甲醇洗脫部位 0.010 38.8±0.6b1.5 60%甲醇洗脫部位 0.004 38.0±0.8 3.6 80%甲醇洗脫部位 0.002 38.8±0.7b1.5原兒茶酸 0.002 40.6±0.3c-3.0連翹酯苷B 0.002 40.2±0.4c-2.0異毛蕊花糖苷 0.002 40.6±0.6c-3.0毛蕊花糖苷 0.002 39.5±1.5c

2.4 裸花紫珠提取物對FIB的影響

與溶媒對照比較,粗提物,40%甲醇洗脫部位1個部位,連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷3個單體的纖維蛋白原(FIB)均明顯延長,有統(tǒng)計學意義;與粗提物比較,60%甲醇洗脫部位、原兒茶酸明顯縮短,有統(tǒng)計學意義;其中40%甲醇洗脫部位優(yōu)于于粗提物。結果見表4。

表4 裸花紫珠提取物對FIB的影響(±s,n=3)

注:與溶媒對照比較,aP＜0.05,bP＜0.01;與粗提物比較,cP＜0.05。

組別 劑量(g/mL) FIB(g/L) 提高率(%)溶媒對照 — 3.76±0.30—21.3粗提物 0.050 4.73±0.18b25.8水洗脫部位 0.033 4.23±0.13 12.5 40%甲醇洗脫部位 0.010 4.89±0.31b30.1 60%甲醇洗脫部位 0.004 4.18±0.20c11.2 80%甲醇洗脫部位 0.002 4.25±0.04 13.0原兒茶酸 0.002 4.14±0.12c10.1連翹酯苷B 0.002 4.41±0.36a17.3異毛蕊花糖苷 0.002 4.40±0.67a17.0毛蕊花糖苷 0.002 4.56±0.13b

3 討論

目前市場上由裸花紫珠提取制成的制劑有裸花紫珠膠囊、裸花紫珠顆粒、裸花紫珠片、滅滴消炎栓與復方木麻黃片等[7-8],這些制劑的藥用原料僅限于裸花紫珠浸膏或其水粗提物,顏色深,成分雜,對裸花紫珠凝血活性部位及其化學成分未有明確研究,也就是說迄今為止,尚不清楚裸花紫珠凝血作用的化學物質基礎,阻礙了裸花紫珠藥用產品的研制。凝血酶原時PT能準確、有效地反映外源性凝血系統(tǒng),TT能有效地反映內源性凝血系統(tǒng),APTT反映內、外源共同性凝血系統(tǒng),FIB是通過對纖溶系統(tǒng)的影響反映凝血效果[9-10]。本實驗通過測定其PT、TT、APTT、FIB四項指標觀察裸花紫珠對凝血系統(tǒng)的影響,結果發(fā)現裸花紫珠4個分離部位中,以40%甲醇洗脫部位凝血效果最好,最接近于裸花紫珠粗提物,說明裸花紫珠凝血有效部位可能在40%甲醇洗脫部位。毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、連翹酯苷B,這3個單體都有較好的凝血效果,而它們又主要在40%甲醇洗脫部位,進一步確證裸花紫珠凝血有效部位可能在40%醇洗脫部位,具體確切的有效成分和作用機理還需深入研究。

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Effects of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system

ZHANG Li,HUANGSheng,YAN Xiao-jie,et al. Guangxi Key Laboratory of Functional Phytochemicals Research and Utilization,Guangxi Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Guilin 541006,China

LIDian-peng,E-mail:ldp@gxib.cn

Objective To study the effect of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system.M ethods The effect of active fraction from Callicarpa nudiflora on blood coagulation system were observed with prothrombin time(PT),activated partial thromboplastin time(APTT),thrombin time(TT)and fibrinogen(FIB)of the constituents blood sampleswere tested.Results Compared with the blank control,Callicarpa nudiflora extract could significantly lessen PT,TT,APTT,and could obviously increased the content of FIB;40%Methanol elution par could significantly lessen TT,APTT,and could obviously increased the content of FIB.Conclusion The hemostatic effect of active fraction from Callicarpa nudiflora may be 40%Methanol elution par of Callicarpa nudiflora.

Callicarpa nudiflora; Hemostatic; Mice; Prothrombin time

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2015.11.021

2015-06-15)

(本文編輯:董歷華)

國家科技支撐計劃(SQ2010BAJY1411-07-05);海南省中藥現代化專項(2012ZY020);廣西植物研究所與九芝堂股份有限公司橫向合作項目;廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室主任基金項目(ZRJJ2014-7)

541006桂林,廣西植物功能物質研究與利用重點實驗室廣西植物研究所(張利、顏小捷、楊子明、李典鵬);九芝堂股份有限公司(黃勝、谷陟欣);海南九芝堂藥業(yè)有限公司(黃勝)

張利(1983-),本科,助理實驗師。研究方向:植物活性物開發(fā)與利用研究。E-mail:345576619@qq.com

李典鵬(1968-),博士,研究員。研究方向:植物活性物開發(fā)與利用研究。E-mail:ldp@gxib.cn