應用納米技術和納米材料醫療器械評價的相關問題

陳寬

納米技術的出現和發展，對于醫療器械技術的進步具有極為重大的意義。納米技術為人類提供了在納米尺度上對材料進行加工和制造的手段，納米物質具有許多獨特的性質，如高比表面積、可控的親水/疏水性質、多功能性、主動/被動靶向、尺寸排阻等，在新型藥物投送系統、體外診斷試劑、植入物和組織工程產品中均具有廣闊的應用前景。與同樣化學組成的傳統物質相比，納米物質可以通過多種方式進入人體，如吸入，根據尺寸和形狀的不同，吸入的納米物質可能沉積在呼吸道和肺組織中，并可以經由肺上皮細胞進入血液并到達遠端組織［1］。某些納米物質，如納米二氧化錳，可以通過嗅神經進入腦組織［2］。而這一方式是傳統物質所無法實現的。為了實現對使用納米技術或包含納米材料的醫療器械進行有效監管，首先應做到正確識別產品生產過程是否使用了納米技術或納米材料。FDA在其指導原則中［3］，強調其監管產品范圍中對是否應用納米技術的考慮:(1)所含材料是否在納米尺度(1～100 nm);(2)所含材料是否具有依賴尺寸的物理、化學，或者生物性質，甚至可以超出納米尺度范疇，上限可達1 000 nm。除尺寸依賴的性質外，FDA還強調了“人造”材料，即將那些天然形成的以及無意之間偶然產生的，尺寸在納米尺度的物質排除在外。

1 應用納米材料的醫療器械技術監管中遇到的問題及研究進展

1.1 納米材料的鑒別和表征 目前，由于不斷有研究工作揭示出與納米材料相關的風險。企業為規避監管，可能不會宣稱其產品使用了納米材料或者在產品的生產過程中應用了納米技術。因為國家食品藥品監督管理總局早在2006年就將納米產品從Ⅱ類升級為Ⅲ類，并對其安全性和有效性進行審慎的考察。因此，企業并不以納米技術作為其產品的主要宣傳點，在這類情況中，由于納米物質具有某些優異性能，或者在生產工藝中需要采用納米技術，從而可能產生一批沒有貼納米標簽的，實質上的納米產品。

對于此類產品，在技術審評工作中，首先要求審評人員具備一定的專業知識，能夠從企業遞交的注冊資料中準確判斷產品中是否有納米物質成分，或者在生產中采用了納米技術。為了準確鑒別醫療器械中是否使用了納米材料，證明等同性非常重要。化學成分的相似性并不足以證明納米材料的等同性，因為納米材料是否呈現出特定性質可能取決于納米材料的化學成分和形狀，和(或)納米材料的來源(供貨方)。當判定了產品確實是納米產品之后，對于其安全性和有效性的把握，需要具備必要的納米表征手段知識。對含有納米材料的醫療器械的生物學效應的試驗和評價要求對納米材料進行全面表征。因為納米材料的毒性，不僅取決于其化學成分，也與其粒度(粒度分布)、長徑比、形狀、表面形貌、表面電勢、表面化學、親水(疏水性)、團聚(聚集)態等因素密切相關［4-11］。因此，對于某些產品，可能需要根據掃描電鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡、電感耦合等離子質譜等表征手段所獲得的圖像和數據來判斷其安全性和有效性。

應該根據納米材料的類型和形式，以及器械的預期用途來選取表征方法。對特定物理化學參數的表征通常可采取多種方法。單一的表征方法可能無法提供對于參數的準確評估(例如:粒度分布、表面成分)。在該類情況下，如果可行，可能需要采取補充方法來對需要表征的性質進行充分評估，即采用兩種獨立的表征方法。需要特別注意的是，用不同的方法獲取的有關特定性質的結果不能直接進行對比。例如，正如指導性文件［12，13］所指出的，對于粒徑測定，應至少采用兩種顯微鏡技術(例如:透射電鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡)。

為了對使用納米技術的醫療器械進行可靠的表征，需要毒理學、物理學、化學、工程學和其他專業領域的專家之間的跨專業合作。

1.2 納米材料劑量 用于毒理學研究的劑量水平通常是以質量濃度為基礎。然而，納米材料的多個屬性可能會影響其毒理性質。普遍認為，除了質量濃度以外，還應使用包括表面積和數量濃度在內的其他參數來充分表征納米材料劑量。

在確定用于納米材料體外研究的毒理學相關的劑量時，應該考慮可分沉淀物的可能性［14-16］。小納米顆粒(例如:水動力學直徑＜40 nm)與培養細胞層之間的接觸主要取決于擴散和對流力。由于沉降力的額外影響，在細胞培養基中形成的稍大的納米材料和納米材料聚集體的沉淀速度更快。這些因素，以及與蛋白質和培養基其他成分的相互作用，可能會影響直接接觸培養細胞的顆粒的數量。

應該根據具體情況評價可分沉淀物出現的可能性。若有必要，應開展對于體外細胞劑量的分析性或計算性評估［15，16］。目前，對介質中的劑量(分散/溶液濃度)或實際的納米顆粒細胞攝入/接觸量是否應該被用于劑量本身的表達還存在爭議。

1.3 納米材料參照樣品 試驗結果的可靠性在一定程度上取決于是否可獲得適合的參照樣品。參照樣品指擁有一項或多項特性參數、具有足夠可重復性的已經確認的材料。可利用該材料或物質對儀器進行校準，評估測量方法或為材料賦值。

納米尺度參照樣品的最初研發重點在于將其用于校準試驗儀器，而不是作為生物響應基準進行參照樣品研發。開發一種廣泛接受的參照樣品，包括在適合不同的試驗系統的陽性對照與陰性對照納米顆粒方面達成共識，已經成為納米材料風險評估的一個關鍵性要求［17］。雖然參照樣品對于評估醫療器械中應用的納米材料至關重要，但是因為存在實際困難，研發進度還是很慢。

認識到納米材料代表性樣本的可用性對于納米物質安全試驗的可重復性和可靠性至關重要。ISO/TC 229 nm技術委員會已提出使用“代表性試驗材料”，并且正對其進行討論。代表性試驗材料的擬議定義為“來自同一批的物質，在其一個或多個特定性質方面具有同質性和穩定性，被認為適合于開發用于針對除已表現出的同質性和穩定性以外的性質的試驗方法［18］”。目前這種方法已被應用于OECD人造納米材料工作組的納米材料安全性試驗合作項目，該項目使用歐洲委員會聯合研究中心代表性納米材料庫中的代表性納米材料來進行。

1.4 納米材料樣品制備 納米材料體積小，并且其物理化學特性可能發生改變，這使得與宏觀(非納米尺度)顆粒或化學物質的試驗相比，納米材料的樣品制備會遇到重大的挑戰。帶來挑戰的因素包括能加強納米材料反應性的表面性質;聚集或團聚顆粒的形成;納米顆粒在通過水合作用，部分溶解或其他過程的分散中發生的轉變;以及低濃度水平污染物對納米材料的物理化學性質和毒理性質的強烈潛在影響。如同其他類型的試驗樣品，納米物體有可能吸附到容器表面。因此，確認標稱濃度非常重要。

對于研發針對含有納米材料的醫療器械的可靠的樣品制備方案來說，必須認識到這些問題。相比于使用常規材料的醫療器械，解決這些問題也許需要極大提高直接針對樣品制備的研發力度，并制定處理策略。

由于其獨特的表面性質，納米材料對用于樣品制備的技術表現出極強的敏感性。顆粒之間以及顆粒與周圍環境之間的相互作用會影響顆粒的分散。分散的納米材料不一定呈現單分散顆粒的形式。呈聚集形式的單分散顆粒(由強結合或強融合的顆粒組成的顆粒)和呈團聚形式的非單分散顆粒(弱結合顆粒，聚集體，或兩者的混合體)可以出現在以液體、粉末和氣溶膠形式出現的納米材料中，除非通過表面電荷或立體效應進行穩定化處理。因此，樣品中納米材料的分散狀態和粒度分布可能隨時間變化。這一屬性對于制備浸提液和(或)儲存溶液和劑量分散溶液有著非常重要的意義，pH值、離子強度或分子成分的輕微調整就可能顯著改變顆粒分散度。基于該原因，受試品的穩定性對于在生物評價中獲取具有代表性的和可重復性的結果來說顯得尤為重要。

納米材料的樣品制備可能包含對于制造商生產的或供應商提供的材料的表征，以及制備用于動物試驗或體外實驗的儲存溶液和劑量溶液。制備細節可能根據給藥途徑和遞送方法的不同而有所差別。

1.5 納米材料對于生物相容性研究試驗的影響 將納米材料用于試驗系統時，必須認識到需要測定的一些性質可能會受到周圍環境的影響，并且在很大程度上依賴于周圍環境(例如:組織培養基、血液/血清、蛋白質存在)。與環境的相互作用可能導致納米材料本身發生暫時性改變，如通過獲得/脫落蛋白涂層，形成納米顆粒團聚/聚集，或納米材料其它方面的變化。由于這樣的變化可能會影響納米材料的特性，因此會影響納米材料的毒性特征。因此，納米材料應完全根據制造出來的形態/組成，以及最終用戶所接收的形式(如果該形式包含自由納米材料)進行表征。最后，還應該對最終產品中的納米材料進行評價。對于生物安全性評價，需要將納米材料分散在適當的介質中進行評價。這些介質與納米材料之間的相互作用可嚴重影響到納米材料在試驗系統中的表現。應該在試驗過程和試驗結果評價過程中考慮該因素。

納米物體在生物環境中很容易將蛋白質迅速吸附在其表面，形成所謂的蛋白質“冕暈”。據報道，冕暈是由兩層結構組成，內層是由強結合的蛋白質組成，而外層是由快速交換的分子組成［19］。蛋白質冕暈并不是靜態的，可能根據納米材料所處環境的不同而發生改變。

作為有機體內的異物，納米材料的歸宿為從被吸收、分布、代謝到排泄/消除。眾所周知，納米材料表現出與其對應的常規材料不同的物理化學特性(力學、化學、磁學、光學或電學特性)，因此，可以合理的期望納米尺度材料會影響生物學行為，并且生物學行為會引發在細胞、亞細胞和生物分子層面(例如:基因和蛋白質)包括細胞攝取的各種不同反應。因此，與由常規材料引發的毒理學反應所不同的各種毒理學反應可能在接觸到納米材料后才會顯現。應該注意的是，不僅蛋白質會以冕暈形式參與這個過程，而且脂質也會參與這個過程［20］。

因此，毒物動力學研究應被視作針對含有納米材料的醫療器械開展的毒理學風險評估的一個部分。

當接觸到生物環境的時候，納米材料會與蛋白質發生相互作用，這種相互作用的定量和定性水平取決于生理環境的性質(例如，血液、血漿、細胞質等)和納米材料的特性。同樣，當接觸到試驗介質的時候，納米材料也會與周圍環境發生相互作用并且/或者也會對環境產生干擾，這取決于其本身的性質和所接觸的條件;跟相應的常規材料相比，它們可能會有不同的表現。因此，對于任何被設計用來對醫療器械進行生物學評價的試驗方法，對其進行專門的驗證是十分有必要的。試驗方法的選擇將取決于納米材料的特性。

在納米材料的毒性試驗中，有幾個已知的風險因素應該避免。對納米材料的毒性和最終結局了解的還不多，所以一些未知的隱患還會在將來逐漸顯露出來。由于納米材料的毒性試驗存在許多不確定性，所以公開透明變得至關重要。

潛在的生物相互作用不是直接取決于分子的濃度或數量，而是取決于納米顆粒本身。在納米毒理學中，劑量反應關系的單位可能不是傳統意義的質量單位，而可能是以納米顆粒的數量或者他們的總表面積來表示劑量。除了表征以外，還應該以文件的形式記錄下實驗條件的詳細情況。

2 納米材料標準化工作

對于醫療器械技術審評工作而言，國家標準和行業標準就是準繩和依據。做好采用納米技術或包含納米物質產品的技術審評工作，標準同樣十分重要。然而，當前國際上納米技術標準的制定工作也只是處于起步階段，我國是全世界最早開始從國家層面制定納米技術標準的，但也僅僅是從2003年全國納米技術標準化委員會成立才開始［21］。國際上，ISO納米技術委員會TC 229于2005年成立［21］，并自2006年起開始制定針對納米材料內毒素的測量標準的國際標準ISO 29701［22］。美國材料測試協會ASTM也于同年成立了E 56納米技術委員會，并相繼制定出了E 2524-08《納米顆粒溶血性質分析的標準測試方法》，E 2525-08《評估納米顆粒材料對小鼠粒細胞-巨噬細胞集落形成影響的標準測試方法》以及E 2526-08《評估納米顆粒材料在豬腎細胞和人肝癌細胞中的細胞毒性的標準測試方法》。ISO TC194的第17工作組也為ISO 10993系列標準制定了第22部分，即《醫療器械的生物學評價-納米技術》。

以上這些標準制定工作為我們開展針對采用納米技術的醫療器械產品的審評工作提供了參考，但更多的工作需要審評人員與來自各個學科的專家密切合作。納米產品種類繁多，不可能有一個單一的評價標準。還要我們在今后的審評工作中多總結，從中提煉出審評要點，并進而形成指導原則，與專家們一道把握好納米技術醫療器械的審評工作。

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