Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤動物模型建立①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博，魯艷梅，涂麗莉

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科，黑龍江 佳木斯 154003)

Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤動物模型建立①

李英夫，李明軍，廉曉宇，宣兆博，魯艷梅，涂麗莉

(佳木斯大學附屬第一醫院神經外科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤模型，為膠質瘤藥物的藥效學研究提供實驗基礎。方法：采用立體定向技術，將體外培養的SHG-44膠質瘤細胞濃縮懸液，5×106/10μL接種于Wistar大鼠的右側尾狀核區，種植后連續觀察大鼠的生存狀態，并于7d行MRI掃描，將未成瘤的大鼠去除，分別于7d、14d、21d、自然死亡幾個區間觀察大鼠的生存狀態，21d處死和自然死亡的大鼠，取腦制作病理切片，HE染色，光鏡下觀察。結果：1周內均較活潑，全部正常，術后1～2周表現為表現為精神萎靡，反應遲鈍，食欲不振，活動減少，體重下降，步態不穩，2周后上述癥狀加重，逐漸有死亡的大鼠。HE染色可明顯觀察到大鼠腦膠質瘤的形成。結論：建立的Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤動物模型可靠穩定， 其腫瘤生長特性及病理特征與人腦膠質瘤相似，可作為臨床膠質瘤研究的理想模型。

腦膠質瘤模型；Wistar大鼠；SHG-44； 病理學

神經膠質瘤發病率高，是顱內常見的惡性腫瘤，約占顱內腫瘤的35.26%～60.96%[1，2]，膠質瘤是惡性腫瘤之一，威脅著人類的健康， 目前膠質瘤的治療以手術治療為主，術后給予放療和化療，以及其它方面的治療，包括基因治療、免疫治療等，但是膠質瘤的預后較差，隨著膠質瘤研究的逐漸深入，需要建立穩定的膠質瘤模型，是臨床藥效學評估的基礎，C6膠質瘤細胞來源于Wistar大鼠的額葉，SHG-44來源于人膠質瘤細胞，從生物學特性上看，更接近于人的膠質瘤細胞，將SHG-44細胞接種于Wistar大鼠右側尾狀核區，腫瘤細胞植入成功，血腦屏障也逐漸建立，因此Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤模型更接近于人類的腦膠質特性，這是更理想的膠質瘤模型，本課題組參照其它相關文獻[3～6],成功建立Wistar大鼠SHG-44腦膠質瘤模型，現將具體情況報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

SHG-44細胞株，Wistar雄性大鼠，體重160～200g。試劑主要包括：F12K培養基、胎牛血清、馬血清， 10%甲醛平衡灌注固定液胎牛血清。主要儀器包括:超凈工作臺，腦立體定向儀，倒置顯微鏡，MCO175 型二氧化碳培養箱， 25μL微量注射器，臺式冷凍離心機。

1.2 實驗方法

1．2.1SHG-44細胞懸液制備

SHG-44來源于人額葉星形膠質瘤的穩定培養，具有特異性標志膠質酸性纖維蛋白(GFAP)，SHG-44是目前較理想的細胞株，能夠穩定的培養，并在Wistar大鼠尾狀核區成功植入，將復蘇成功的SHG-44細胞株，放于50cm2培養瓶中接種，DMEM培養基中含有10%滅活的胎牛血清，還含有鏈霉素100mg/mL、青霉素100U/mL、NaHCO33.7g/L，培養瓶置于5%CO2的培養箱中，溫度恒定于37℃，SHG-44細胞滿瓶后,將培養液傾倒出去,0.25%胰酶消化培養瓶中的SHG-44細胞,顯微鏡下觀察SHG-44細胞，當細胞開始皺縮時,加入營養液,并反復吹打，使SHG-44細胞脫壁,并用離心機離心5min，離心轉數為1000r/min，將上清液棄出，制成106細胞/瓶的細胞懸液,接種于25cm2培養瓶中。

1.2．2 動物模型制作前準備

全實驗過程每周兩次注射地塞米松，0.15mg腹腔內注射，接種前3d，每日給予地塞米松，劑量為100g體重1mg，給藥方式為灌胃，降低排斥反應，用10%水合氯醛麻醉，給藥劑量為每100克體重0.4mL，剪去穿刺點周圍毛，面積約1.0cm×1.5cm。

1.2.3 模型制作

植入靶點為右側尾狀核區，穿刺點為矢狀縫右旁開3.5mm和前囟中點前1.0mm，麻醉滿意后，將Wistar大鼠固定于立體定向儀上，剪去穿刺點周圍毛,高效碘消毒,鋪無菌洞巾，切開內眥連線與正中矢狀面交點向后1mm，定位預先穿刺點，牙科鉆顱骨鉆孔，直徑1.2mm，用1mm微量注射器針頭刺破硬膜，向下垂直進入硬膜下6mm, 再后撤1mm，將細胞懸液1×106/20μL，以每分鐘1μL的速度緩慢注入右側尾狀核區，穿刺針停留5min，骨蠟封閉骨孔，縫合頭皮。

1.2.4 觀察指標

7d時進行頭部MRI檢查，將成瘤的大鼠作為實驗對象，分別于接種后的7d、14d、21d、自然死亡的幾個時間點觀察大鼠的生存狀態，包括如下幾個方面：飲食情況；肢體是否有活動障礙；顱神經是否有功能確實；以及視覺反應；全身抽搐和持續時間等。21d處死大鼠和死亡的大鼠進行H-E染色，光鏡下觀察[5]。

2 結果

2.1 腦瘤鼠行為學表現為

大鼠術后1d逐漸恢復飲食及活動，2d后基本恢復到術前狀態，1周內均較活潑，全部正常，術后1～2周表現為表現為精神萎靡，反應遲鈍，食欲不振，活動減少，體重下降，步態不穩，2周后上述癥狀加重，逐漸有死亡的大鼠。移植的Wistar大鼠動物50只，顱內出血致死4%(2/50),感染致死6%(3/50),意外傷害致死2%(1/50),顱內成瘤21只，成瘤率42%。

2.2 組織病理學

以多聚甲醛灌注主動脈，取腫瘤組織，甲醛固定，制成標本，用HE染色，顯微鏡下表現為核大、染色較深，并在腫瘤中心區切片可見壞死區，邊界不清。

3 討論

膠質瘤為中樞神經系統的惡性腫瘤，如何提高其治療效果，延長患者生命，科研工作者和神經外科醫生在不斷的探索，VottorionM等認為[7]，理想的腦膠質瘤動物模型應具備以下特點：具備惡性膠質瘤細胞的生物特性；體外培養能生長；成瘤的時間較短，能夠測定腫瘤的生長率，動物生存期穩定；腫瘤模型與人腦膠質瘤相似的生長特性；用于治療的模型須能夠模擬人腦膠質瘤臨床治療過程。本課題組用立體定向方法將SHG-44細胞植入到Wistar大鼠右側尾狀核區域，成功建立Wistar大鼠腦膠質瘤模型，大鼠成瘤后可出現明顯的行為學改變，有較典型的癥狀。H-E染色，光鏡下觀察腫瘤呈侵襲性生長，建立的Wistar大鼠SHG-44膠質瘤動物模型基礎上，觀察大鼠的行為學改變，為抗膠質瘤藥物的藥效學研究提供了借鑒，更好的選擇時間窗。

腦膠質瘤原位移植瘤動物模型的成功建立，應從以下幾個方面嚴格操作，現做如下總結，模型制作過程，要求操作精細，控制好細胞數量、細胞增殖活力、靶點的確定、進針的速度和深度以及與靶點腦組織接觸時間，細胞注射速度等方面嚴格操作，首先保證細胞的數量和活力，接種SHG-44大鼠腦膠質瘤細胞活力應>90%，達不到標準不能操作，接種前將細胞懸液置于恒溫搖床中，溫度恒定于37℃，留置時間不超過90min，接種前輕輕搖晃，以保證細胞懸液均勻，接種細胞的數量是影響模型成功率的關鍵，要保證細胞的數量，其次，穿刺針進入不能過深，也不能過淺，過深會導致大鼠死亡，過淺細胞 會向外溢出，把握好進針深度，是模型能否成功的關鍵因素之一，注射SHG-44懸液要把握好注射速度，保證細胞懸液植入在腦內，緩慢退針后，骨臘封閉骨孔，通常在腫瘤生長較慢的時期，進行對比實驗能更好地判定治療效果[8]。成瘤的大鼠，7d大鼠腦內腫瘤己經形成，但其生存狀態良好;7～14d隨診腫瘤的生長，大鼠表現為食欲減退、反應下降，14d后上述癥狀明顯，部分大鼠出現偏癱、眼眶淤血、精神萎靡、體重下降較快。從以上觀察看，進行藥效學觀察的時間點選在接種后10～14d為好。總之，按照上述方法進行的腦膠質瘤模型的制備，可以達到臨床腦膠質瘤藥效學研究的要求，因此，Wister大鼠SHG-44腦膠質瘤模型是可靠的動物模型。

[1]王忠誠主編. 王忠誠神經外科學[M]. 湖北：科學技術出版社, 2004,518

[2]WaraWM,BanmanGS,Sneedpk,etal.Brain,Brainstem,andCerebellum.InPerezCA,BrdyLM,eds.PrinciplesandPracticeofRadiationOncology[M].Philaddelphia:Lippincott-RavenPublishers, 1998,800-810

[3]GrobbenB，DeDeynPP，SlegersH，etal．RatC6gliomaasexperimentalmodelsystemforthestudyofglioblastomagrowthandinvasion[J]．CellTissueRes， 2002，310(3):257-270

[4]姬西團，章翔，陳燕，等． 立體定向大鼠腦膠質瘤顱內接種生長情況的觀察[J]． 中國神經免疫學和神經病學雜志，2005，12 ( 5) :311-314

[5]吳景文，章翔，高大寬，等． 建立大鼠C6腦膠質瘤模型與觀察顱內腫瘤生長[J]． 第四軍醫大學學報， 2000，21(3):307-310

[6]WatanabeK，SakamotoM，SomiyaM，etal．FeasibilityandlimitationsoftheratmodelbyC6gliomasimplantedatthesubcutaneousregion[J]．NeurolRes，2002，24:485-490

[7]蔡山，楊智勇.腦膠質瘤原位移植瘤動物模型的研究進展[J].實用臨床醫學，2007,8(2)：134-138

[8]白永文，于如同，倪鳴山，等．大鼠腦膠質瘤動物模型的建立及其形態學的初步觀察[J]．徐州醫學院學報，2004，24 (4):331-334

黑龍江省衛計委課題項目，編號：2014-222。

李英夫(1979～)男，黑龍江明水人，碩士，主治醫師。

李明軍(1965～)男，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫師。E-mail:liyingfu79@sohu.com。

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1008-0104(2015)02-0024-02

2015-01-02)