刺玫果提取物膠囊定性定量研究

鐘方麗， 楊 揚，2， 王曉林*， 薛健飛， 張林林

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大學 化學學院， 長春 130012)

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刺玫果提取物膠囊定性定量研究

鐘方麗1， 楊 揚1，2， 王曉林1*， 薛健飛1， 張林林1

(1.吉林化工學院 化學與制藥工程學院， 吉林 吉林 132022; 2.吉林大學 化學學院， 長春 130012)

建立刺玫果提取物膠囊的定性鑒別和含量測定方法.采用薄層色譜法對刺玫果提取物膠囊進行了定性分析；采用紫外-可見分光光度法，建立了刺玫果提取物膠囊總黃酮的含量測定方法；采用高效液相色譜法，建立了刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷的含量測定方法.結果表明建立的薄層色譜鑒別方法，熒光斑點清晰，陰性無干擾；蘆丁在4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996)，金絲桃苷在0.192～1.152 μg (r=0.9999)線性關系良好；蘆丁平均回收率100.05%，RSD為1.40% (n=6)；金絲桃苷平均回收率99.39%，RSD為0.66%(n=6).建立的薄層鑒別方法專屬性高，含量測定方法具有良好的精密度，結果準確可靠，可用于刺玫果提取物膠囊的質量控制.

刺玫果提取物； 膠囊； 含量； 金絲桃苷； 總黃酮

刺玫果提取物膠囊是由刺玫果經提取、純化加工而成，具有理氣活血的作用，可用于治療冠心病、高脂血癥等.刺玫果藥材中所含的總黃酮類物質具有防治高血脂和血栓所致的心腦血管疾病的功效[1-2]，為了控制該膠囊的質量，本試驗建立了膠囊中槲皮素的薄層鑒別，并采用UV、HPLC法分別建立了總黃酮和金絲桃苷的含量測定方法，從而為保證刺玫果提取物膠囊的活性效果提供了依據.本文以蘆丁為對照品，采用UV法對刺玫果提取物膠囊中總黃酮的含量、采用HPLC法對刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷的含量進行了測定，并采用TLC法對刺玫果提取物膠囊中的槲皮素進行了鑒別.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺玫果提取物膠囊(批號20140201、20140301、20140401、20140402、20140403)及陰性對照樣品為吉林化工學院化學與制藥工程學院藥學系自制.乙腈、四氫呋喃均為色譜純(天津市北方天醫化學試劑廠)；甲醇、冰乙酸為色譜純(天津市大茂化學試劑廠)；水為重蒸餾水；其他化學試劑均為分析純；蘆丁對照品(批號：100080-200707)，金絲桃苷對照品(批號：111521-201004)，均為含量測定用，購于中國食品藥品檢定研究院.

1.2 儀器與設備

TU-1810紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；LC2030高效液相色譜儀(上海天美科學儀器有限公司)；AEG-220電子天平(日本島津)；KQ-250B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；ZF-20D暗箱式紫外分析儀(上海寶山顧村電光儀器廠).

2 結果與分析

2.1 薄層色譜鑒別

取重量差異項下的刺玫果提取物膠囊內容物，研細，取約0.1 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加60%乙醇適量，超聲使溶解，放冷并稀釋至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，作為供試品溶液.另精密稱取干燥至恒重的槲皮素對照品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，作為對照品溶液.另取淀粉等輔料制成的陰性膠囊2粒，按上述供試品溶液制備方法同法制成陰性對照溶液.照《中國藥典》2010 年版一部附錄Ⅵ B薄層色譜法試驗[3-5]，吸取上述3批供試品溶液、槲皮素對照品溶液及陰性對照溶液各5 μL，分別點于同一層析硅膠(G)薄層板上，以醋酸乙酯-甲酸(8∶1)為展開劑，展開，取出，再晾干，以5%AlCl3乙醇溶液均勻噴灑，晾干，置于紫外分析儀(365 nm)下檢視，結果如圖1所示.在與對照品色譜相應的位置上，顯有相同顏色的熒光斑點，陰性對照則無相應的斑點.

1、2、3-供試品；4-金絲桃苷；5-槲皮素；6-陰性對照

2.2 總黃酮含量測定

本品由刺玫果一味中藥經提取純化而制成，具理氣活血之功效.刺玫果主要成份為黃酮類、多種三萜酸及沒食子酸甲酯等.黃酮類是主要活性成份，為此本文采用紫外-可見分光光度法測定樣品中總黃酮的含量[6].

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解，定容，搖勻，配制成0.2 mg/mL的對照品溶液，備用.

2.2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項下的本品約0.2 g，研細，精密稱定，置50 mL量瓶中，加60%乙醇適量,超聲使其溶解，冷卻并稀釋至刻度，搖勻過濾，棄去初濾液，備用.

2.2.3 供試品溶液的制備方法的確定

1)提取溶劑的選擇 取重量差異項下的本品約0.2 g，研細，精密稱定，分別以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL為溶媒，對樣品進行超聲提取10 min，分光光度法測定結果顯示：60%乙醇提取溶液吸光度值最大，所以選擇提取溶媒為60%乙醇.

2)提取時間的選擇 取重量差異項下的本品約0.2 g，研細，精密稱定，以50 mL 60%乙醇為溶媒，對樣品進行超聲提取5、10、15、20、25、30 min，分光光度法測定結果顯示：提取時間為15 min時吸光度值最大，所以將超聲時間確定為15 min.

3)提取溶劑用量的選擇 取重量差異項下的本品約0.2 g，研細，精密稱定，以 60%乙醇20、30、40、50 mL為溶媒，對樣品進行超聲提取15 min，分光光度法測定結果顯示：提取劑用量為50 mL，吸光度值最大，提取溶劑量確定為50 mL.

2.2.4 標準曲線的繪制 精密吸取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加4%NaOH溶液10.0 mL，再加60%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min.以未顯色的對照品溶液為空白，按照分光光度法，在505 nm處測定其吸光度，以吸收度為縱坐標，蘆丁對照品濃度(mg/mL)為橫坐標，繪制標準曲線[7-8]，進行直線回歸，回歸方程：Y=11.67X+0.0175，r=0.9996.結果表明:蘆丁在4.0～48.0 μg/mL呈良好線性關系.

2.2.5 精密度試驗 吸取對照品溶液2.0 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4節的方法顯色，連續測定6次吸光度，RSD為0.50%，結果表明精密度較好.

2.2.6 穩定性試驗 取同一批號的刺玫果提取物膠囊內容物0.2 g，精密稱定，按供試品溶液的配制方法制成溶液.在同一份供試品溶液中分別于配制后0、1、2、4、6、8、24 h進行顯色，以供試品溶液為空白，在505 nm處測定吸光度值.經計算可得RSD值為2.60%，結果表明供試品溶液顯色前24 h內穩定性良好.取上述的供試品溶液分別在顯色后0、5、10、15、20、25、30、35、40、60 min，在505 nm波長處測定吸光度值.經計算可得RSD值為2.20%，結果表明供試品溶液顯色后60 min內穩定性良好，滿足測定要求.

2.2.7 重復性試驗 取同一批號刺玫果提取物膠囊內容物6份，各0.2 g，精密稱定，按2.2.2節的方法制成供試品溶液，吸取0.5 mL于25 mL容量瓶中，按2.2.4節方法顯色，在505 nm處測定吸光度值，RSD為0.28%，結果表明重復性良好.2.2.8加樣回收率試驗 稱取6份總黃酮含量已知的刺玫果提取物膠囊內容物，精密稱定，每份精密加入蘆丁對照品適量，按2.2.2節方法制備供試品溶液，按2.2.4項中方法顯色測定，結果見表1.結果表明回收率良好，方法準確性較高，具有可行性.

表1 蘆丁加樣回收率試驗

2.2.9 樣品含量測定 按上述膠囊總黃酮含量測定方法測定樣品含量，5批刺玫果提取物膠囊中每粒含總黃酮的結果分別為100.51、107.20、115.63、105.65、112.24 mg.

2.3 金絲桃苷含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的金絲桃苷對照品2.40 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.096 mg/mL金絲桃苷對照品溶液[9].

2.3.2 供試品溶液的制備 取重量差異項下的本品，研細，取約0.1 g，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，超聲10 min使溶解，放冷并稀釋至刻度，搖勻，過濾，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液.

2.3.3 供試品溶液的制備方法的確定

1)提取溶劑的選擇 取重量差異項下的本品約0.1 g，研細，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別以30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇50 mL為溶媒，對樣品進行超聲提取10 min，微孔濾膜(0.45 μm)過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為996 67、164 449、123 056，結果顯示：60%乙醇作提取溶劑，相同條件下，峰面積更大，即含提取物質含量最高.

2)提取時間的選擇 取本品膠囊內容物約0.1 g，研細，精密稱定，置25 mL量瓶中，以 60%乙醇25 mL為溶媒，對樣品進行超聲提取5、10、15、20、25 min，微孔濾膜(0.45 μm) 過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為99 167、488 575、207 068、175 226、88 524，實驗結果表明超聲提取10 min，金絲桃苷含量更大.

3)提取溶劑用量的選擇 取重量差異項下的本品約0.1 g，研細，精密稱定，置25 mL量瓶中，以60%乙醇10、15、20、25、30 mL為溶媒，對樣品進行超聲提取10 min，微孔濾膜(0.45 μm) 過濾，取續濾液作為供試品溶液，進樣20 μL，金絲桃苷峰面積分別為653 157、295 247、264 404、305 020、305 125，實驗結果表明提取溶劑用量在25 mL時即可將金絲桃苷提取完全.

2.3.4 陰性對照溶液的制備 取淀粉等輔料制成的陰性對照膠囊，按2.2.2節下方法制備陰性對照溶液.

2.3.5 色譜條件及適應性試驗 色譜柱：伊利特C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：乙腈-甲醇-四氫呋喃-0.5%醋酸溶液(1∶1∶19∶79)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：360 nm[10]；柱溫：30℃；進樣量：20 μL.在此色譜條件下，金絲桃苷的保留時間為16.08 min，金絲桃苷與其他成分分離度大于1.5，理論塔板峰按金絲桃苷峰計算為3323，陰性對照在相應的保留時間無吸收峰出現.HPLC圖見圖2.

2.3.6 標準曲線的繪制 精密吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置10 mL容量瓶中，加入60%乙醇定容至刻度，搖勻，制得系列對照品溶液.分別吸取20 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以對照品溶液進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線[11-13]，回歸方程為：Y=3×106X-5.75×105，R=0.9999，結果表明金絲桃苷進樣量在0.192～1.152 μg范圍內呈良好的線性關系.

2.3.7 重復性試驗 取同一批號的刺玫果總黃酮膠囊內容物5份，每份各0.1 g，按上述方法制備5份供試品溶液，各進樣20 μL，進行測定，金絲桃苷的峰面積RSD為1.17%，表明方法有良好的重復性.

2.3.8 儀器精密度試驗 按上述色譜條件，精密吸取濃度為0.384 μg/mL的金絲桃苷對照品溶液，連續進樣6次，每次進樣20 μL，記錄金絲桃苷的峰面積，結果金絲桃苷的峰面積RSD為0.69%，結果表明精密度良好.

2.3.9 穩定性試驗 取供試品溶液，室溫下放置，分別于1、2、3、4、5 h進樣20 μL，記錄色譜圖，結果金絲桃苷的峰面積RSD為0.95%，表明供試品溶液在5 h內穩定.

2.3.10 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量(1.35 mg/g)的樣品0.1 g，每份精密加入濃度為0.096 mg/mL金絲桃苷對照品溶液1.40 mL，按照上述方法制備供試品溶液，定容到10 mL容量瓶中，微孔濾膜過濾，按上述色譜條件各進樣20 μL，記錄峰面積，計算回收率，金絲桃苷的平均回收率為99.39%，RSD為0.66%.結果見表2.

A.對照品溶液； B.供試品溶液； C.陰性溶液

表2 金絲桃苷加樣回收率試驗

2.3.11 樣品含量測定 按上述膠囊金絲桃苷含量測定方法測定樣品含量，5批樣品中每粒含金絲桃苷測定結果分別為280.75、278.84、276.59、280.28、275.62 μg.

3 結論與討論

3.1 薄層色譜條件的選擇

3.1.1 展開劑的選擇 分別以醋酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)、苯-醋酸乙酯-甲酸(6∶4∶1)、氯仿-甲醇-水(28∶10∶1)、醋酸乙酯-甲酸(8∶1)為展開劑對展開系統進行比較，結果顯示：醋酸乙酯-甲酸(8∶1)系統槲皮素Rf值適中，斑點分離效果好.

3.1.2 硅膠板的選擇 吸取供試品溶液3批、槲皮素對照品溶液及陰性對照溶液，分別考察了自制硅膠G板(玻璃片基)、自制硅膠H板(玻璃片基)、層析硅膠(G)薄板(鋁箔片基)、層析硅膠(G)薄板(玻璃片基)的展開效果.結果表明，層析硅膠(G)薄板(鋁箔片基)展開效果良好，熒光斑點清晰.

3.1.3 顯色劑的選擇 本實驗分別選用5%AlCl3、9%FeCl3溶液為顯色劑，依前述方法顯色.結果顯示，均勻的噴灑5%AlCl3硅膠板上有明顯的熒光斑點；均勻的噴灑9%FeCl3溶液顯色劑顯色，硅膠板成黑色，熒光斑點不清晰.

3.1.4 供試品濃度及點樣量的選擇 分別稱取刺玫果提取物膠囊內容物0.05、0.10、0.15 g，按供試品溶液的配制方法配制成不同濃度的供試品溶液，用微量注射器分別吸取2、3、5 μL供試品溶液樣于硅膠(G)薄層板.結果顯示稱取0.10 g膠囊內容物配制的供試品溶液，點樣量為5 μL時，斑點清晰，Rf值適中，效果較好.

3.2 總結

本試驗分別采用HPLC、UV法對刺玫果提取物膠囊中金絲桃苷、總黃酮的含量進行了測定，并建立了刺玫果提取物膠囊中槲皮素的薄層鑒別方法.本試驗建立的槲皮素薄層鑒別方法，斑點清晰，Rf值適中；建立的金絲桃苷含量測定方法專屬性強、陰性無干擾、線性關系良好，回收率、重現性符合要求；建立的總黃酮含量測定方法線性關系及回收率良好.上述方法可以作為刺玫果提取物膠囊的質量控制方法.

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Study on the quality standard of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule

ZHONG Fangli1， YANG Yang1，2， WANG Xiaolin1， XUE Jianfei1， ZHANG Linlin1

(1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering， Jilin Institute of Chemical Technology， Jilin，Jilin 132022;
2. School of Chemistry， Jilin University， Changchun 132022)

To establish the qualitative identification and content determination methods of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule. TLC was used to accomplish the qualitative identification， while UV and HPLC were applied to determine the content of total flavonoids and hyperin of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule respectively. There was no negative interference in established TLC method， which offered clear fluorescent spots. Rutin and hyperin showed good linear relationship at the range of 4.0～48.0 μg/mL (r=0.9996) and 0.192～1.152 μg (r=0.9999) respectively. The average recovery of rutin and hyperin were 100.05% and 99.39%， while theirRSDwere 1.40%(n=6) and 0.66% (n=6). TLC method obtained was specific and content determination methods were accurate and reliable， which could be applied for quality control of the fruits extract ofRosadavuricaPall. capsule．

fruits extract ofRosadavuricaPall.; capsule; content; hyperin; total flavonoids

2014-11-08.

吉林省科技廳計劃項目(20110948).

1000-1190(2015)02-0228-05

R944

A

*通訊聯系人. E-mail: wangxiaolin69 @eyou.com.