Wangzaozin A調節NADPH氧化酶源性活性氧誘導HL-60細胞分化

丁 蘭， 陳祎平， 劉國安， 吳炎鵬

(西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070)

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Wangzaozin A調節NADPH氧化酶源性活性氧誘導HL-60細胞分化

丁 蘭*， 陳祎平， 劉國安， 吳炎鵬

(西北師范大學 生命科學學院， 蘭州 730070)

利用臺盼藍排染法、吉姆薩染色及流式細胞術對對映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A影響人早幼粒白血病細胞HL-60生長、細胞形態、NBT還原能力、細胞吞噬及細胞表面抗原CD11b表達進行了檢測.結果顯示，0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A抑制HL-60細胞生長，0.6和0.8 μmol/L處理組細胞顯示了明顯的G1期周期阻滯.隨著wangzaozin A濃度升高及處理時間延長，細胞核質比減小，腎形核、桿狀核和分葉核細胞增多及胞質中顆粒狀物質增加；同時，細胞NBT還原能力、吞噬能力及細胞表面抗原CD11b表達顯著增強，表明wangzaozin A可誘導HL-60細胞向成熟粒細胞分化.進一步利用熒光探針DCF檢測顯示0.6和0.8 μmol/L wangzaozin A處理細胞12 h后細胞內ROS顯著升高；抗氧化劑NAC及NADPH氧化酶抑制劑APO顯著抑制wangzaozin A誘導HL-60細胞上調CD11b表達，表明wangzaozin A可通過上調NADPH氧化酶源性的活性氧濃度誘導HL-60細胞分化.

wangzaozin A； HL-60細胞； 分化； 活性氧； NADPH氧化酶

急性髓性白血病(AML)主要源于細胞內多種造血轉錄因子的破壞，導致細胞分化受阻進而發展成為癌癥[1].20世紀80年代，全反式維甲酸(ATRA)被成功用于急性早幼粒細胞白血病(APL，為AML的一種亞型)的臨床分化治療[2]，維甲酸類化合物成為APL臨床分化治療最具代表性的分化誘導劑，其誘導分化機制成為腫瘤分化治療的前沿研究領域.研究證實，大多數APL具有特征性染色體t(15;17)易位，形成早幼粒細胞白血病基因和維甲酸受體α(RAR-α)基因的融合基因(PML-RARα)，該基因編碼的融合蛋白阻止APL細胞分化和凋亡[3-4]；ATRA和As2O3均能靶向作用于APL融合蛋白PML-RARα，使之降解，進而誘導APL細胞分化和凋亡[5-6].ATRA的分化治療及其與As2O3的聯合治療成為了APL治療的成功范例.然而，臨床治療所伴隨的ATRA綜合癥及耐藥性等問題嚴重影響了分化治療的療效，因此，發現新的靶向分化誘導劑是解決耐藥性、毒副作用及提升療效的最佳途徑.

香茶菜屬植物的主要次生代謝產物對映-貝殼杉烷二萜已分離鑒定約500余種，其研究主要集中于植物化學成分及其分子結構確定，有關生物活性的報道較少但逐年增多，其中良好的抗癌活性引起了極大關注[7-9]，某些對映-貝殼杉烷型二萜被認為有望成為新的抗癌先導化合物[10].最近，該類化合物對不同類型的白血病細胞的靶向作用研究取得了重要進展：腺花素(adenanthin)直接靶向作用于過氧化氧化還原蛋白Ⅰ和Ⅱ，抑制其活性，通過升高急性早幼粒細胞白血病細胞NB4細胞活性氧濃度，激活相關信號通路，誘導NB4細胞分化[11]，并顯示了對不同類型的白血病細胞的分化誘導作用[12]；川藏香茶菜甲素(pharicin A)可直接與紡錘體組裝檢點蛋白BubR1結合，干擾BubR1功能，誘導白血病Jurkat和Raji細胞阻滯于M期[13]；川藏香茶菜乙素(pharicin B)能迅速穩定多種AML細胞內的RAR-α蛋白，顯著增強ATRA的分化誘導作用[14]；冬凌草甲素(oridonin)可與致癌蛋白AML1-ETO結合，使其產生截短的AML1-ETO，選擇性地誘導t(8;21)白血病細胞凋亡[15].這些研究結果表明，不同分子骨架的對映-貝殼杉烷型二萜可多靶點作用于白血病細胞，誘導其分化及凋亡，契合了中醫學的“多靶點效應”，充分顯示了該類化合物對白血病分化治療的潛在價值.然而迄今為止，對不同分子構型的對映-貝殼杉烷二萜的分化誘導機制的研究還極少.本課題組對一種C-20位未氧化型對映-貝殼杉烷二萜wangzaozin A在分子結構確定，細胞毒性的構效關系，細胞生長抑制及凋亡誘導方面進行了系統的研究[9,16-19]，發現wangzaozin A在較高濃度下(3.0～4.0 μmol/L)可損傷HL-60細胞DNA，使細胞大量細滯于S期，誘導細胞凋亡[9].本文首次報道wangzaozin A在低濃度下(0.4～0.8 μmol/L)影響HL-60細胞NADPH氧化酶，上調細胞活性氧水平，進一步誘導HL-60細胞向成熟粒細胞分化，證明了wangzaozin A具有與已報道的對映-貝殼杉烷二萜具有完全不同的作用靶點.而且不同濃度wangzaozin A可誘導完全不同的細胞應答，產生不同的活性效應，這對于該類化合物的抗白血病機制深入研究以及發展新型分化誘導劑具有重要價值.關于NADPH氧化酶介導天然有機小分子誘導細胞分化的報道還很少，本研究也為天然分化誘導劑的篩選與研究提供新思路.

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RPMI1640培養基購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(DMSO)購自Merck公司；臺盼藍、碘化丙啶(PI)、硝基四氮唑藍(nitrotetrazolium blue chloride，NBT)、佛波酯 (phorbol esters，TPA)、夾竹桃麻素(apocynin，APO)、吉姆薩均為Sigma公司產品；RNase A購自北京 Solarbio公司；活性氧檢測熒光探針DCFH-DA (2′，7′-dichlorfluoresceindiacetate)、抗氧化劑NAC (N-acetylcysteine)購自江蘇碧云天生物技術研究所；FITC標記的小鼠抗人CD11b單抗，購自德國Biosciences公司；吞噬熒光探針P(HPMA-FMA)由本實驗室合成[20]；其他化學藥品為國產分析純.

對映-貝殼杉烷型二萜化合物wangzaozin A由本實驗室從甘肅產總序香茶菜(Isodonracemosa(Hemsl) Hara)中分離得到，并采用現代波譜學方法(紫外、紅外、質譜、核磁共振和X-單晶衍射)對其結構進行了確定，為純度99.5%以上的單體化合物[16]，使用前用DMSO配制成20 mmol/L母液儲存于4℃冰箱.其化學結構如圖1所示.

圖1 Wangzaozin A化學結構式Fig.1 The chemical structure of wangzaozin A

CO2培養箱(美國 Forma Scientific)、超凈工作臺(蘇凈集團，江蘇)、倒置顯微鏡(Leitz-diavert)、正置熒光顯微鏡(Leica DMI4000B，德國)、流式細胞儀(Beckman Coulter Cell Lab Quanta SC Flow Cytometer，美國)、高速低溫離心機(BeckmanCoulter Allegra64R，美國).

1.2 細胞培養

人早幼粒白血病細胞株HL-60引自蘭州大學生命科學學院.細胞培養于含10%小牛血清的RPMI-1640培養基中(含100 U/mL青霉素與100 μg/mL鏈霉素)，置于37℃，5% CO2飽和濕度恒溫箱中培養.

1.3 臺盼藍排染法檢測細胞生長與存活

取對數生長期的HL-60細胞懸液，以濃度為2×104個/mL接種于24孔培養板中，每孔300 μL，于37℃預培養24 h，分別加入受試藥物wangzaozin A(0、0.2、0.4、0.6和0.8 μmol/L)及ATRA(2 μmol/L).每隔24 h收集細胞，取0.4%臺盼藍溶液以1∶4與細胞懸液充分混勻，染色3～5 min 后吸取適量混合液，用血球計數板在光鏡下活細胞計數，取平均值，以時間為橫坐標，活細胞數為縱坐標繪圖.所有實驗組均設3個重復.

1.4 流式細胞術檢測細胞周期分布

將濃度為2×104個/mL的HL-60細胞懸液以每孔3 mL接種于6孔板，預培養24 h后分別加入不同濃度的wangzaozin A(0～0.8 μmol/L)或ATRA(2 μmol/L)，繼續培養48 h和72 h后，1000 r/min離心5 min，棄上清液，預冷的PBS洗2次，加入70%乙醇，在-20℃下固定過夜.1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇后用PBS洗2次，加入RNase A，終濃度為100 μg/mL，37℃孵育30 min后，再加入PI(碘化丙啶)，終濃度為40 μg/mL，避光孵育30 min后，260目的尼龍網過濾，上機檢測.

1.5 吉姆薩染色觀察細胞核形態變化

細胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細胞，PBS洗2次后用甲醇-冰乙酸(3∶1)固定30 min，鋪片，晾干后用PBS配制的Gimesa工作液染色20 min，用蒸餾水沖洗干凈，于顯微鏡下觀察拍照.

1.6 細胞NBT還原能力測定

細胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細胞，PBS洗2次.將待測細胞以106/mL密度重懸于PBS (含2 mg/mL NBT和200 ng/mL TPA)中，37 ℃孵育30 min，離心去上清，涂片，光鏡下觀察胞漿內含灰藍色顆粒為陽性細胞.計數300個細胞，計算NBT陽性細胞率.

細胞接種濃度及藥物處理如1.4.待藥物處理72 h后加入熒光探針P(HPMA-FMA)[20]，使其每孔終濃度為30 μg/mL，繼續孵育3 h，離心收集細胞，PBS洗2次，加入1 mL的PBS混勻，吸取500 μL細胞懸液涂片，于熒光顯微鏡下觀察拍照，其余500 μL用于流式細胞儀檢測.

1.8 流式細胞術檢測HL-60細胞表面抗原CD11b表達

細胞接種濃度及藥物處理如1.4.離心收集藥物處理72 h后的細胞，PBS洗2次，調整細胞濃度為106/mL，取500 μL細胞懸液加入5 μL的 FITC-CD11b，避光靜置孵育30 min，PBS洗1次，于流式細胞儀檢測細胞CD11b表達.

1.9 DCFH-DA單染色法檢測HL-60 細胞ROS水平

細胞接種濃度及藥物處理如1.4.藥物處理12 h、24 h后，離心收集細胞，PBS 洗2次.每個樣品加入DCFH-DA (10 μmol/L) 熒光探針，37℃孵育30 min，每隔5 min搖勻一次，PBS洗2次，去除未進入細胞內的 DCFH-DA，上流式細胞儀檢測.

1.10 NAC聯合wangzaozin A影響HL-60 細胞CD11b表達的測定

將濃度為2×104個/mL的HL-60 細胞懸液以每孔3 mL接種于6孔板，培養24 h后，分別加入終濃度為0.6 μmol/L wangzaozin A或0.5 mmol/L NAC或0.6 μmol/L wangzaozin A+0.5 mmol/L NAC，繼續培養72 h，收集細胞，PBS洗2次后調整細胞濃度為106/mL，每500 μL細胞懸液加FITC-CD11b抗體 5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，于流式細胞儀檢測CD11b表達.

1.11 APO聯合wangzaozin A影響HL-60 細胞CD11b表達的測定

a) 在PLC梯形圖程序設計軟件里，需做如下設置：打開系統塊設置窗口→通信端口設置→PLC地址：2→最高地址：31→波特率：19.2 kbps。將程序重新下載至PLC中。

將HL-60細胞以2×104/mL接種至6孔板，每孔3 mL細胞懸液，培養24 h后，分別加入終濃度為0.6 μmol/L wangzaozin A或0.4 mmol/L APO或0.4 mmol/L APO+0.6 μmol/L wangzaozin A，繼續培養72 h，收集細胞，1000 r/min離心5min，棄上清，加PBS洗2次后調整細胞濃度為106/mL，每毫升細胞懸液加入FITC-CD11b 抗體5 μL，避光孵育30 min，PBS洗1次，流式細胞儀檢測CD11b表達.

1.12 數據統計

采用SPSS11.0統計學軟件進行數據分析:實驗所得數據采用x±SD表示(n=3)，實驗組與對照組用t檢驗，實驗組的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2 實驗結果

2.1 Wangzaozin A對HL-60細胞生長的抑制作用

不同濃度的wangzaozin A 處理HL-60細胞24 h、48 h、72 h和96 h后，用臺盼藍排染法檢測活細胞數，結果如圖2所示.與對照相比，wangzaozin A(0.2～0.8 μmol/L)在96 h內對HL-60細胞顯示了生長抑制作用，并具有劑量和時間依賴效應.對照組細胞在培養96 h之后由于細胞數量過多，受培養基營養限制出現部分死亡，而所有處理組細胞的存活率均大于97%.2 μmol/L ATRA處理組在48 h內與0.4 μmol/L wangzaozin A的抑制活性相當，培養72 h后其抑制活性處于0.4～0.6 μmol/L wangzaozin A之間.

圖2 Wangzaozin A對HL-60細胞生長抑制作用Fig.2 The growth inhibition of wangzaozin A on HL-60 cells

流式細胞術進一步檢測發現，0.2～0.8 μmol/L的wangzaozin A處理HL-60細胞48 h和72 h后G1期細胞增多，0.6～0.8 μmol/L處理組呈現明顯的G1期阻滯；72 h處理組G1期阻滯率高于48 h處理組，同時顯示了相應的劑量和時間依賴效應(見圖3).

圖3 Wangzaozin A引起HL-60細胞周期阻滯Fig.3 The cycle arrest of HL-60 cells caused by wangzaozin A

2.2 Wangzaozin A誘導HL-60 細胞分化

2.2.1 細胞形態變化提示細胞向成熟粒細胞分化

0.2～0 .8 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細胞72 h后經吉姆薩染色顯示，對照組細胞的核大，多為近圓形，核質比高，核仁清晰；經wangzaozin A處理后，細胞核形不規則，呈現出腎形核(圖4紅色箭頭)、桿狀核(圖4綠色箭頭)和分葉核(圖4藍色箭頭)細胞，并且細胞核質比減小，胞質中顆粒狀物質增加，與ATRA處理組細胞的變化相似.隨著wangzaozin A濃度的升高，腎形核、桿狀核和分葉核細胞數量增加，提示細胞趨向成熟粒細胞分化(見圖4).

A：對照.B:0.2 μmol/L wangzaozin A.C:0.4 μmol/L wangzaozin A.D:0.6 μmol/L wangzaozin A．E:0.8 μmol/L wangzaozin A.F:2.0 μmol/L ATRA (×400)．

2.2.2 Wangzaozin A增強細胞NBT還原能力 Wangzaozin A對HL-60細胞的NBT還原能力的影響如圖5所示.不同濃度的wangzaozin A均可增加細胞內甲臜的沉淀及細胞著色，并隨著藥物濃度增加細胞著色加深，陽性細胞率增加.0.4 μmol/L藥物處理組與對照組比，具有顯著性差異(P<0.05)；0.6 μmol/L wangzaozin A處理組的陽性細胞率與2 μmol/L ATRA處理組相近，提高3倍多;0.8 μmol/L 處理組的陽性細胞率提高約4.5倍，與對照組比這3組均達到極顯著差異(P<0.01).

2.2.3 Wangzaozin A增強HL-60細胞吞噬能力

對顆粒性異物的吞噬性是粒細胞及巨噬細胞的特性之一，可作為細胞分化程度的特征標志.P(HPMA-FMA)為本實驗室合成的高分子熒光探針[20]，與細胞孵育后可通過熒光強度變化確定培養細胞的吞噬特性.利用熒光顯微鏡可視化檢測HL-60細胞對高分子熒光顆粒物質P(HPMA-FMA)的吞噬活性，發現對照組細胞有較弱的顆粒吞噬能力，而經wangzaozin A處理HL-60細胞72 h后，處理組細胞的熒光強度均有增強，表明細胞對熒光顆粒的吞噬能力增強，其中0.6 μmol/L wangzaozin A處理組與2.0 μmol/L ATRA處理組熒光強度相當(見圖6 A).流式細胞術檢測數據進一步證明wangzaozin A可顯著增加HL-60細胞吞噬能力.與對照組相比，0.2 μmol/L、 0.4 μmol/L、0.6 μmol/L和0.8 μmol/L wangzaozin A處理組細胞的熒光強度分別增加了126±7 %、141±10.5 %、163±8.8%和183±9%，并顯示了濃度依賴性.ATRA處理組的增加率為159%，與0.6 μmol/L 處理組接近(見圖6 B).

A：顯示不同濃度wangzaozin A及ATRA處理HL-60 細胞72 h后細胞著色變化 (×400). a：對照組.b:0.2 μmol/L wangzaozin A.c:0.4 μmol/L wangzaozin A.d:0.6 μmol/L wangzaozin A.e:0.8 μmol/L wangzaozin A.f:2.0 μmol/L ATRA.B：不同濃度wangzaozin A及ATRA處理HL-60 細胞72 h后NBT陽性細胞率．

A： 0.6 μmol/L wangzaozin A和2.0 μmol/L ATRA處理HL-60細胞72 h后細胞吞噬P(HPMA-FMA)的熒光顯微鏡圖像(×400).B： 藥物處理HL-60細胞72 h后，細胞吞噬納米熒光顆粒P(HPMA-FMA)的能力．

2.2.4 Wangzaozin A上調HL-60細胞表面抗原CD11b的表達 在血細胞的分化過程中CDllb被認為在原始粒細胞上基本不表達，隨著細胞的成熟分化，CDllb表達逐漸升高，因而可作為細胞分化程度的檢測指標.不同濃度的wangzaozin A和ATRA處理HL-60細胞72 h后，利用流式細胞術檢測其細胞表面CD11b蛋白表達量.如圖7所示， 與對照組相比，0.4～0.8 μmol/L處理組細胞CD11b的表達顯著上升，均達到極顯著水平.ATRA處理組細胞CD11b表達量略高于0.6 μmol/L處理組.

圖7 Wangzaozin A及ATRA處理HL-60細胞72 h后對細胞CD11b表達的影響Fig.7 The effects of wangzaozin A and ATRA on the expression of CD11b of HL-60 cells

2.3 活性氧介導wangzaozin A對HL-60細胞的分化誘導

2.3.1 Wangzaozin A上調HL-60細胞ROS濃度 為了探討ROS是否參與化合物誘導HL-60細胞的分化，利用ROS熒光探針DCF及流式細胞術對細胞內的ROS進行檢測.不同濃度的wangzaozin A及2.0 μmol/L的ATRA處理HL-60細胞12 h和24 h后，細胞內ROS含量的變化結果如圖8所示.0.6 μmol/L及0.8 μmol/L的wangzaozin A處理細胞12 h后能引起細胞內ROS的升高，并具有顯著性差異，但24 h處理組ROS濃度變化不明顯；ATRA處理組與0.6 μmol/L wangzaozin A處理組的結果相似，升高細胞內ROS濃度，與對照相比具有顯著性差異.

圖8 Wangzaozin A和ATRA處理HL-60 細胞12h或24 h后細胞內ROS 含量的變化Fig.8 The change of ROS in HL-60 cells after treatments with wangzaozin A and ATRA for12h or 24 h

2.3.2 NAC抑制wangzaozin A對HL-60細胞的分化誘導作用 為了檢測wangzaozin A誘導HL-60細胞的分化是否是與活性氧信號相關聯，我們將抗氧化劑NAC(0.5 mmol/L)與wangzaozin A(0.6 μmol/L)聯合處理細胞72 h后，用流式細胞術檢測細胞表面CD11b表達情況，判斷聯合作用下NAC對wangzaozin A誘導HL-60細胞分化的影響.如圖9所示，0.6 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細胞72 h后可顯著升高細胞CD11b表達，與對照組相比，達到極顯著差異(P<0.01).0.5 mmol/L的NAC單獨處理HL-60細胞72 h后對細胞CD11b表達水平無影響；當0.6 μmol/L wangzaozin A與NAC聯合處理HL-60細胞72 h后，與0.6 μmol/L wangzaozin A組相比，細胞CD11b表達顯著下降，與對照組相比無顯著差異，表明抗氧化劑NAC降低或消除細胞活性氧后對wangzaozin A誘導的HL-60細胞分化具有明顯的抑制效應，說明活性氧介導了wangzaozin A誘導的分化作用.

2.3.3 APO抑制wangzaozin A對HL-60細胞的分化誘導作用 APO可抑制細胞質膜NADPH氧化酶活性，減弱或消除由NADPH氧化酶所產生的活性氧.APO與wangzaozin A的聯合使用可判斷誘導HL-60細胞分化的活性氧信號來源是否與NADPH氧化酶相關聯.從圖10可以看出，APO聯合wangzaozin A處理組與wangzaozin A單獨處理組相比，HL-60細胞的CD11b表達顯著下降，僅為單獨處理組的63.2%.表明APO對NADPH氧化酶活性的抑制介導了wangzaozin A對HL-60細胞分化的誘導.

圖9 NAC對wangzaozin A誘導HL-60細胞表達CD11b的影響Fig.9 The effect of NAC on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

圖10 APO對wangzaozin A誘導HL-60 細胞表達的影響Fig.10 The effect of APO on the expression of CD11b in HL-60 caused by wangzaozin A

3 討論

香茶菜屬植物冬凌草作為抗炎及抗癌的藥物已臨床使用多年，其有效成分冬凌草甲素(oridonin)具有靶向作用于癌蛋白AML1-ETO進一步誘導白血病細胞凋亡的作用[15]，該化合物已有白血病臨床試驗訊息.最近，另一種對映-貝殼杉烷二萜腺花素(adenanthin)誘導白血病細胞分化及其靶向作用PxⅠ/Ⅱ的機制為該類化合物抗白血病研究提供了新途徑[11].

細胞增殖受阻及細胞周期的停滯是細胞分化的重要特征[21].研究顯示， wangzaozin A 在0.2～0.8 μmol/L時顯著抑制HL-60細胞增殖，延緩細胞周期進程，引起G1周期阻滯，但對其存活無影響，這與該化合物在完全生長抑制濃度下(3.0～4.0 μmol/L)處理36 h后引起S期阻滯及大量細胞凋亡完全不同[9]，顯示了該化合物在不同劑量及處理時間誘導了不同的細胞應答信號途徑.綜合分析wangzaozin A處理HL-60細胞后其細胞形態、NBT還原能力、細胞吞噬能力及細胞表面黏著因子CD11b表達的變化，圖片及測試數據均顯示wangzaozin A誘導HL-60細胞向成熟粒細胞分化.經0.4～0.8 μmol/L wangzaozin A處理HL-60細胞72 h后腎形核細胞明顯增多，隨著處理時間延長其桿狀核和分葉核細胞逐漸增多，且吞噬性增強，這些特征是粒細胞成熟最顯著的細胞學標志[22-23]，其分子標記CD11b在處理組細胞表達升高的證據進一步支持了wangzaozin A可誘導HL-60細胞向成熟粒細胞分化的判斷[24].Wangzaozin A誘導HL-60細胞分化的模式與全反式維甲酸及DMSO誘導分化模式相類似[25-26].

研究證實，ROS作為胞內信號分子參與細胞增殖、分化及凋亡等多種信號途徑的調控[27]，并且ROS在干細胞或祖細胞的分化過程中是一個關鍵的調節因子[28].細胞內ROS有多種來源，包括尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase)、線粒體呼吸鏈、黃嘌呤氧化酶以及環氧合酶等，而在受體介導的信號傳導過程中起作用的ROS主要源于NADPH氧化酶，通過其活性精確調節控制細胞內ROS水平[29-30].目前已證實，NADPH氧化酶源性的ROS可通過p38 MAPK途徑激活心肌基因相關轉錄因子，調控胚胎干細胞向心肌細胞分化[31-32]，為心肌干細胞移植治療心肌梗塞提供了新的研究靶點.Chen[33]證實黃酮化合物異甘草素(Isoliquiritigenin)在翻譯和轉錄水平上調NADPH氧化酶的gp91phox 和p47 phox亞基表達，提高ROS水平，誘導HL-60細胞向單核細胞分化.外源H2O2也可影響NADPH氧化酶，升高ROS濃度，誘導HL-60細胞分化[34].本文中wangzaozin A處理HL-60細胞12 h后細胞內活性氧濃度顯著升高，在該處理組中加入活性氧清除劑NAC后HL-60細胞CD11b表達下調，明顯減弱wangzaozin A對HL-60細胞CD11b表達的上調誘導，表明ROS介導了wangzaozin A對HL-60細胞的分化作用；NADPH氧化酶抑制劑APO也可減弱wangzaozin A誘導的分化作用，進一步揭示wangzaozin A誘導的HL-60細胞分化是通過NADPH氧化酶對活性氧生成的調控，即wangzaozin A可能通過激活HL-60細胞NADPH氧化酶，上調ROS濃度，調控相關信號通路，誘導HL-60細胞分化.

本研究提示NADPH氧化酶是干預HL-60細胞分化的重要因子，而Liu[11]報道另一種對映-貝殼杉烷二萜腺花素(adenanthin)可靶向作用另一種早幼粒白血病細胞NB4的過氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，抑制其對ROS的清除作用，誘導NB4細胞分化，顯示了相似分子構型的對映-貝殼杉烷二萜可通過兩種不同途徑影響細胞內ROS水平.另外，沒有證據顯示adenanthin誘導的分化作用與NADPH氧化酶無關，或者wangzaozin A不能影響過氧化還原酶系統，但兩個實驗體系的證據均將其分化信號指向了活性氧水平的升高.從理論上講，進入細胞的化合物可與細胞內多種蛋白質相互作用，其親和性及作用部位不同，對不同蛋白質功能產生不同影響.重要的是，細胞針對不同信號刺激，整合信號通路進行應答反應.盡管我們的結論尚需在分子水平進一步證實wangzaozin A影響NADPH氧化酶功能的機制，但已有的證據提示wangzaozin A具有抗白血病的潛在價值.

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Wangzaozin A regulates NADPH oxidase-derived reactive oxygen species to induce the differentiation of HL-60 cells

DING Lan， CHEN Yiping， LIU Guoan， WU Yanpeng

(College of Life Sciences， Northwest Normal University， Lanzhou 730070)

The effects of wangzaozin A， a kind ofent-kaurane diterpenoids， on the growth， cellular morphology， NBT-reducing ability， cellular uptake and cell surface markers CD11b of HL-60 cells were determined by trypan blue exclusion method， giemsa stainning and flow cytometry. The results showed that 0.2～0.8 μmol/L wangzaozin A could inhibit the growth of HL-60 cells， cells treated with 0.6 and 0.8 μmol/L wangzaozin A presented obviously G1 arrest. With the increase of the concentration of wangzaozin A and the treatment time， metamyelocytes， banded neutrophils and segmented neutrophils increased， nuclear/cytoplasm ratio decreased， granular substance in cells increased; at the same， NBT-reducing ability， cellular uptake and the expression of CD11b of HL-60 cells enhanced remarkedly， with a obvious dose-and time-dependent manner. The results showed that differentiation of human HL-60 cells into granulocyte could be induced by wangzaozin A. Further， the detection by fluorescence probe DCF showed that ROS in cells treated with 0.6 and 0.8 μM wangzaozin A after 12 h increased obviously; the expression of CD11b induced by wangzaozin A could be markedly inhibited by antioxidant NAC and APO which is the inhibitor of NADPH oxidas. It indicated that wangzaozin A could induce the differentiation of HL-60 cells by up-regulating concentration of NADPH oxidase-derived reactive oxygen species．

wangzaozin A; HL-60 cells; differentiation; ROS; NADPH oxidase

2014-12-01.

國家自然科學基金項目(30960464).

1000-1190(2015)02-0252-09

Q28

A

*E-mail: dinglan@nwnu.edu.cn.