癲癇持續狀態大鼠海馬中食欲素受體1隨時間演變的規律

陳亞楠，朱 飛，楊 楠，左萍萍，李瑞生，郎森陽，王湘慶

1解放軍總醫院 神經內科，北京 100853；2北京協和醫學院 基礎學院藥理室，北京 100005；3解放軍第302醫院 動物實驗中心，北京 100039

癲癇持續狀態大鼠海馬中食欲素受體1隨時間演變的規律

陳亞楠1，朱 飛1，楊 楠2，左萍萍2，李瑞生3，郎森陽1，王湘慶1

1解放軍總醫院 神經內科，北京 100853；2北京協和醫學院 基礎學院藥理室，北京 100005；3解放軍第302醫院 動物實驗中心，北京 100039

目的探討癲癇持續狀態后癲癇模型大鼠海馬中食欲素受體1 (orexin receptor-1，OX1R)隨時間演變的規律。方法實驗3月齡雄性Wistar大鼠100只，體質量250 ～ 400 g，隨機分為實驗組(KA組)和對照組(NS組)，實驗組采用海人酸(kainic acid，KA)腹腔注射誘導大鼠癲癇持續狀態的模型，在癲癇持續狀態30 min后終止發作，分別于終止發作后4 h、1 d、1周、1個月、2個月處死大鼠，對照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，處理同實驗組，隨后行免疫組化染色和Western-blot方法檢測OX1R的變化。結果兩種檢測方法均提示實驗組(KA組)和對照組(NS組)隨著鼠齡(3 ～ 5個月)的增加，海馬內OX1R表達均隨呈上升趨勢，在各個時間點KA組海馬各區OX1R的表達均高于NS組，但兩組差異無統計學的意義(P ＞ 0.05)。結論在癲癇持續狀態大鼠及對照組大鼠中，海馬CA1區、CA3區及齒狀回(dentate gyrus，DG) OX1R的表達與癲癇發作無相關性，但隨著鼠齡的增長海馬各區OX1R的表達均隨時間呈增多趨勢，提示隨鼠齡增加海馬OX1R表達逐漸增多。

癲癇持續狀態；大鼠；海馬；食欲素受體1

癲癇為神經科常見疾病，以反復發作為特點，對認知和記憶均有損害，且癲癇持續狀態為急危重癥，具有較高的死亡率和致殘率[1-2]。食欲素(Orexin)為一種神經肽，包括Orexin-A和Orexin-B(也被稱作下丘腦分泌素1和下丘腦分泌素2)，可以通過與其相應的食欲素受體1 (orexin receptor-1，OX1R)和食欲素受體2 (orexin receptor-1，OX2R)結合參與機體的能量代謝、攝食、睡眠-覺醒周期的調控[3-4]。食欲素系統中OX1R和OX2R均為G蛋白偶聯受體，Orexin-A選擇性地與OX1R相結合而發揮其相應的作用，其中OX1R對配體有嚴格的選擇性(其配體主要為Orexin-A)，而OX2R則對配體(Orexin-A或Orexin-B)沒有嚴格的選擇性[5]。曾認為分泌的食欲素神經元僅存在于下丘腦中[6]，而Morales等[7]和陳福順等[8]研究發現，在海馬中也存在Prepro-OX mRNA的表達，且在匹羅卡品誘導癲癇持續狀態后的1 ～ 3 d內表達上調，表明食欲素系統與癲癇之間可能存在一定的內在聯系。食欲素主要通過與OX1R或OX2R相結合形成突觸傳遞系統來發揮其與飲食、交感神經活動、睡眠與覺醒狀態以及癲癇等相關的生理作用[9]。有報道發現，反復癲癇發作患者腰穿腦脊液中Orexin-A濃度較非癲癇患者降低，提示Orexin-A可能與癲癇發作有一定聯系。Orexin-A主要作用于OX1R，其結合能力約為OX2R的10倍[9]。已有研究發現，Orexin-A與癲癇有一定聯系，而OX1R為Orexin-A較為重要的受體，所以我們以OX1R作為研究對象，旨在進一步探索食欲素系統參與癲癇發作的機制。

材料和方法

1 主要儀器和試劑 冷凍切片機為Lei CA CM 1900，Olympus BX53顯微鏡，海人酸(kainic acid，KA)(編號K0250)購自Sigma公司，Anti-Orexin Receptor 1 antibody (編號ab68718)購自Abcam公司，超敏即用型二步法(非生物素)檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

2 動物分組及模型制作 3月齡雄性Wistar大鼠100只，體質量250 ～ 400 g，由解放軍第302醫院動物中心提供。本實驗符合衛生部實驗動物使用與管理指導意見和解放軍第302醫院實驗倫理委員會有關規定。實驗大鼠分籠飼養，供應充足的飼料和水，供動物自由攝取。動物房室溫22℃，濕度20% ～ 30%，12 ～ 12 h明暗交替。實驗大鼠飼養適應1周后，隨機分為實驗組(KA組)和對照組(NS組)。按動物體質量大小編號，隨機分為5組，每組5只。1)KA組：經腹腔注射KA(8 mg/kg)誘發急性癲癇發作，持續發作30 min后給予地西泮(1 mg/kg)終止發作，按發作后時間點分為4 h、1 d、1周、1個月、2個月組；2)NS組：與實驗組相對應地分為4 h、1 d、1周、1個月、2個月組，在相同時間給予腹腔注射等量的0.9%氯化鈉注射液(normal saline，NS)。實驗組和對照組的子組根據其時間分組的情況分別在4 h、1 d、1周、1個月、2個月時處死，行免疫組化染色和Western-Blot法檢測OX1R的表達情況。

3 大鼠癲癇分級標準 觀察并采用錄像機監測大鼠癲癇發作程度及發作時間。發作程度按Racine標準分5級：1級：眨眼、豎毛，胡須抖動、嗅、面部抽搐；2級：點頭運動(頸部肌肉抽搐)、咀嚼運動、嚴重面部肌肉痙攣；3級：一側前肢抬起，輕微陣攣；4級：用后肢站起伴有兩側前肢的陣攣；5級：站立、雙側前肢陣攣加重，失去平衡跌倒伴全身陣攣即在4級的基礎上身體向后倒下。評分在4級或以上者為造模成功[10]。

4 免疫組織化學染色測海馬OX1R神經纖維的分布及密度 用2%硫噴妥鈉(50 mg/kg)將大鼠麻醉后，取大鼠腦組織，置于4%多聚甲醛中放置1周，采用15%、20%、25%、30%的蔗糖溶液梯度脫水，待腦組織脫水后，根據Paxinos大鼠圖譜定位神經核團，修出海馬所在的腦組織，固定后行35 μm的冠狀位連續切片，將切片置于含有凍存液的12孔板中于-20℃保存，每孔25張。每只動物選取3 ～ 4片組織切片，選取對耳線5.7 ～ 6.7 mm內的切片。隨后進行免疫組化染色，染色后采用Image-Pro Plus圖像分析系統定量測定每張切片海馬CA1、CA3和齒狀回的OX1R的神經纖維的積分光密度值(integral optical density，IOD)。

5 Western-blot印跡法測海馬OX1R的表達 將大鼠采用2%硫噴妥鈉(50 mg/kg)麻醉后，直接斷頭取腦，迅速取出海馬組織放入標記好的凍存管內，至于液氮內冰凍，之后放入-80℃保存。進行蛋白定量并計算出每個樣品的上樣體積，根據所需的量，煮蛋白使之變性，置于-20℃保存。隨后可取蛋白進行Western-blot印跡法進行檢測，以β-actin為內參，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析圖片，計算海馬OX1R和β-actin的條帶密度比值。

6 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件對結果數據進行處理，數據采用-x±s表示，單因素方差分析、獨立樣本的t檢驗及秩和檢驗，檢驗標準α= 0.05。

結 果

圖 1 KA組和NS組OX1R積分光密度值在海馬CA1、CA3及DG的變化趨勢Fig. 1 Changes of IOD in CA1, CA3 and DG of hippocampus between KA group and NS group

1 OX1R在海馬CA1區表達 OX1R的積分光密度值在兩組海馬CA1區呈現持續升高趨勢，KA組在4 h、1 d、1周、1個月、2個月時均高于NS組，但差異無統計學意義(P＞0.05)；時間點1 d、1周分別與同組內4 h時OX1R的表達情況比較，差異無統計學意義(P＞0.05)，1個月、2個月與4 h組內的差異有統計學意義(P＜0.01)。實驗組和對照組的OX1R的積分光密度值對比結果及變化趨勢分別見表1和圖1，免疫組化染色見圖2。

2 OX1R在海馬CA3區的表達 兩組OX1R的積分光密度值均呈持續升高的趨勢，KA組在4 h、1 d、 1周、1個月、2個月時均高于NS組，但差異無統計學的意義(P＞0.05)；1 d、1周分別與同組內4 h時OX1R的分布情況相比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)，1個月、2個月與4 h組之間的差異有統計學意義(P＜0.01)。見表2和圖1，免疫組化染色見圖3。

圖 2 KA組和NS組不同時間點大鼠海馬CA1區免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 2 Immunohistochemistry of the CA1 of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

圖 3 KA組和NS組不同時間點大鼠海馬CA3區免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 3 Immunohistochemistry of the CA3 of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

圖 4 KA組和NS組不同時間點大鼠海馬DG區免疫組化染色(左圖為KA組，右圖為NS組)Fig. 4 Immunohistochemistry of the DG of hippocampus (×10) in different time in KA group and NS group (Left: KA group; Right: NS group)

3 OX1R在海馬齒狀回(dentate gyrus，DG)區的表達 兩組中OX1R的積分光密度值在海馬DG區呈現持續升高趨勢，KA組在4 h、1 d、1周、1個月、2個月時均高于NS組，但差異無統計學的意義(P＞0.05)；KA組和NS組內1 d與4 h之間的差異無統計學意義(P＞0.05)，1周、1個月、2個月與4 h組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表3和圖1，免疫組化染色見圖4。

4 Western-blot結果 兩組大鼠海馬中OX1R表達均呈持續升高的趨勢，KA組在各時間點均稍高于NS組，但差異無統計學的意義(P＞0.05)；KA組內1 d、1周、1個月與4 h之間的差異無統計學意義(P＞0.05)，2個月與4 h組之間的差異有統計學意義(P＜0.05)；NS組中各時間點雖均高于4 h組，但差異無統計學意義(P＞0.05)。見表4，Western-blot見圖5。

表1 KA組和NS組OX1R在海馬CA1區的積分光密度值的比較Tab. 1 Changes of IOD in CA1 of hippocampus between KA group and NS group

表2 KA組和NS組OX1R在海馬CA3區的積分光密度值的比較Tab. 2 Changes of IOD in CA3 of hippocampus between KA group and NS group

表3 KA組和NS組OX1R在海馬DG區的積分光密度值的比較Tab. 3 Changes of IOD in DG 1 of hippocampus between KA group and NS group

表4 KA組和NS組OX1R在海馬的表達比較Tab. 4 Changes of the OX1R in hippocampus between KA group and NS group

圖 5 Western-blot檢測大鼠海馬中OX1R表達水平Fig. 5 Western-blot showing expression level of OX1R in hippocampus

討 論

癲癇是由神經環路的損害而導致的反復神經元異常放電所引起的一種疾病，其發作和終止的機制尚未完全明確，可能與多種神經突觸相關。癲癇可反復發作，且可以對患者的學習和認知造成損害[11]。食欲素A已證實和學習與記憶相關，癲癇發作后所引起的記憶力下降可能與Orexin-A減少有關[12]。目前有研究證明，食欲素在獎勵系統和成癮行為上有著重要的作用，已在行為、解剖及神經生理研究中證實外側丘腦與獎勵機制和成癮行為密切相關[13-14]。

本研究結果顯示，KA組與NS組中OX1R在海馬CA1區、CA3區及齒狀回的分布均隨時間呈逐漸升高趨勢，KA組大鼠海馬中OX1R的分布均稍高于NS組，但差異無統計學的意義(P＞0.05)，隨著鼠齡的增長OX1R表達逐漸增多，表明OX1R的分布可能與年齡呈正相關；免疫組化結果中提示KA組和NS組中大鼠CA1區、CA3區OX1R分布在1個月、2個月時與開始(4 h)時的差異有統計學意義(P＜0.01)，在海馬齒狀回1周、1個月、2個月時OX1R的分布與開始(4 h)時的差異有統計學意義(P＜0.05)。陳福順等研究證明，Orexin-A可能參與癲癇的發生發展，但本研究結果并未得出此結論。Hervieu等[15]研究顯示，匹羅卡品誘發癲癇病灶行程中有中間神經元和星形細胞參與，在海馬可能由OX1/OX2受體介導上述過程。本研究結果提示，在癲癇持續狀態終止后，大鼠海馬各區的OX1R并未隨著癲癇發作時間而改變，與Hervieu等[15]的結論不一致，我們發現OX1R的變化趨勢與鼠齡的增長有一定的相關性，目前尚無相關研究報道。

Haj-Dahmane和Shen[16]研究Orexin的鎮痛作用時，發現食欲素系統中的另一個成員Orexin-B可以誘導抑制谷氨酸的釋放，陳福順等[17]也證明在海人酸誘導的癲癇模型中Orexin-B其可能參與了癲癇的神經元放電和傳播的調節，增加其濃度有助于對癲癇的控制。所以食欲素系統中參與癲癇的控制主要因素是否為Orexin-B需進一步的研究證實。食欲素已證實與多種機體行為相關，關于食欲素參與癲癇發生、發展的機制及主要因素仍有待于更深入的研究。

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Changes over time of orexin receptor-1 in hippocampus of status epilepticus rats

CHEN Ya'nan1, ZHU Fei1, YANG Nan2, ZUO Pingping2, LI Ruisheng3, LANG Senyang1, WANG Xiangqing11Department of Neurology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Pharmacology, Institute of Basic Medical Science Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100005, China;3Animal Laboratory Center, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China

WANG Xiangqing. Email: bjxqwang@yahoo.com.cn; LANG Senyang. Email: langsy@263.net

Objective To explore the changes over time of orexin receptor 1 (OX1R) in hippocampus of status epilepticus (SE) rats. Methods One hundred male Wistar rats were divided into model group (KA group) and control group (NS group). Models of SE rats were induced by intraperitoneal injection of kainic acid (KA), SE was terminated 30 minutes later. The rats in control group were injected with 0.9% sodium chloride injection intraperitoneally. Then the changes of OX1R were detected by immunohistochemistry and Western-blot at 4 h, 1 d, 1 week, 1 month, 2 months after the termination of SE in KA group and NS group. Results OX1R in hippocampus of SE rats increased gradually with age in model (KA) and control (NS) group, the IOD of OX1R in KA group was higher than that of NS group, but no signif i cant difference was found between the two groups. Conclusion In the KA and NS group, the changes of OX1R in CA1, CA3 and dentate gyrus (DG) of hippocampus in SE rats or controls are not associated with SE, but the expression of OX1R increases with time which suggests that OX1R increases with the age of rats.

status epilepticus; rats; hippocampus; orexin receptor-1

R 742.1

A

2095-5227(2015)02-0155-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.017

時間：2014-09-29 17:05

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140929.1705.002.html

2014-07-16

國家自然科學基金項目(81271438)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81271438)

陳亞楠，女，本科。專業方向：神經病學。Email: chen yanan7722@163.com

王湘慶，女，博士，副主任醫師。Email: bjxqwang@yahoo. com.cn；郎森陽，女，博士，主任醫師。Email: langsy@263.net