細胞色素氧化酶3A4啟動子報告基因的構建及其活性檢測

張 帆，司 文，高旭東，馮 帆，王春平，楊予濤，楊永平，楊俊蘭

1解放軍總醫院 腫瘤內科，北京 100853；2解放軍第三零二醫院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；3沈陽軍區總醫院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；4首都醫科大學 神經科學研究所，北京 100071

細胞色素氧化酶3A4啟動子報告基因的構建及其活性檢測

張 帆1，司 文1，高旭東2，馮 帆3，王春平2，楊予濤4，楊永平2，楊俊蘭1

1解放軍總醫院 腫瘤內科，北京 100853；2解放軍第三零二醫院 肝臟腫瘤診療與研究中心，北京 100039；3沈陽軍區總醫院 藥劑科，遼寧沈陽 110016；4首都醫科大學 神經科學研究所，北京 100071

目的建立細胞色素氧化酶(cytochrome P-450，CYP)3A4啟動子報告基因并在孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)表達陽性的腫瘤細胞中檢測其轉錄活性。方法利用PCR擴增CYP 3A4的啟動子區遠端調控序列(-7836/-7208)和近端調控序列(-362/+52)序列；將上述序列克隆至pGL3-Promoter載體上；利用螢光素酶報告基因系統檢測CYP 3A4報告基因的活性。結果在肝癌細胞系中，PXR的激動劑利福平能夠劑量依賴性地誘導遠端調控序列熒光素酶報告基因(R2=0.92；P=0.003 4)和近端調控序列熒光素酶報告基因(R2=0.95；P=0.011)的活性，EC50為(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L；PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制利福平誘導的遠端調控序列熒光素酶報告基因(R2=0.92；P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92；P=0.003 4)活性，IC50為(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外，多種化療藥物(PXR的潛在配體)能夠在PXR陽性的腫瘤細胞系中誘導遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因的活性。結論成功構建了CYP 3A4啟動子報告基因，在此基礎上建立了在不同腫瘤細胞中檢測PXR轉錄活性的方法。

細胞色素氧化酶3A4；孕烷X受體；螢光素酶報告基因；轉錄活性

孕烷X受體(pregnane X receptor，PXR)在消化系統器官和腫瘤組織中分布廣泛，其結構由轉錄激活的N-末端結構域(N-terminal domain， N-TD)、保守的DNA結合區(DNA-binding domain，DBD)和高度可變的配體結合的C-末端結構域(ligand binding domain，LBD)組成[1-6]。PXR與配體結合后能夠轉位至細胞核，介導下游基因的轉錄[7]。多種內/外源化學物質被確定為PXR的配體，能夠誘導CYP3A4、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19等多種亞型的CYP 450轉錄[2-3]。其中，CYP 3A4是最為常見的分布廣泛的CYP 450亞型[3]。CYP 3A4的表達量及其催化活性是肝代謝活性等的標志，能夠介導吉非替尼和索拉非尼等化療藥物的氧化代謝。本研究根據基因文庫的序列，選取CYP 3A4啟動子區域中含有PXR結合元件DR3和ER6的遠端調控序列(-7836/-7208)，以及僅含有ER6位點的近端調控序列(-362/+52)，將上述兩段序列克隆到pGL3-啟動子載體上，構建CYP 3A4報告基因，檢測其活性，為后續研究靶向藥物的代謝、清除及耐藥機制奠定基礎。

材料和方法

1 材料 質粒pGL3-Prpmopter和β-gal表達載體均由首都醫科大學楊予濤博士惠賜；胃癌BGC823、肝癌HepG2、大腸癌LS180、肺癌A549和乳腺癌MCF-7等細胞系均由本實驗室保存；所用引物購自賽百盛(SBS)公司，使用pH 8.0的10 mmol/L Tris配置成200 μl溶液；Primary-STAR以及Taq等DNA聚合酶購自寶生物公司(TaKaRa)；限定性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ，以及T4-DNA連接酶購自New England Biolab公司；質粒小提試劑盒、DNA回收試劑盒、PCR產物回收試劑盒以及螢光素酶報告基因試劑盒等均購自Promega公司；含蛋白酶抑制劑(1∶500)的RIPA細胞裂解液、SDS-蛋白電泳Loading Buffer、蛋白Marker以及硝酸纖維素膜(NC膜)購自Bio-Rad公司；蛋白印跡實驗(Western blot)所用抗體購自Santa Cruz公司；化學發光試劑盒(Qiangen公司)；轉染試劑Lipofectin AMINE2000購自Invitrogen公司；CCK-8試劑和牛血清白蛋白購自Amerresco公司；DMEM細胞培養基和胎牛血清購自Gibco公司；細胞培養皿及24孔培養板購自Corning公司；工具藥物利福平和酮康唑購自Sigma公司，分子靶向藥物索拉非尼和吉非替尼購自大連美侖公司，細胞毒性藥物紫杉醇和絲裂霉素購自Sigma公司，全部藥物均由質譜確證其結構正確，采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)檢測其純度＞98%，使用二甲亞砜配制成3 mmol/L的母液，4℃保存。

2 主要設備 PCR儀(ABI公司)；DNA電泳儀、SDS-PAGE電泳儀和半干轉膜儀(Bio-Rad公司)；多功能酶標儀(Wallac公司)；TS-100倒置相差顯微鏡(Nikon公司)。

3 CYP 3A4啟動子區序列的克隆 CYP 3A4啟動子區域中PXR的結合位點XREM(-7836/-7208)和PXRE(-362/+52)序列設計引物，以XhoⅠ和KpnⅠ為限定性內切酶位點，擴增XREM和PXRE序列，PCR產物回收、備用。所用引物：XREM Sense：5′-CGCTCGAGTCTAGAGAGATGGTTCATTCC-3′；Anti-sense 5′-CGGGTACCTCGTCAACAGGTTAAAG GAG-3′；PXRE Sense：5′-CGCTCGAGAGATCTGT AGGTGTGGCTTGTTGG-3′；Anti-sense 5′-CGGGTA CCTGTTGCTCTTTGCTGGGCTATGTGC-3′。

4 XREM-Luc和PXRE-Luc報告基因載體的構建

將pGL3-Prpmopter載體和PCR產物使用XhoⅠ和KpnⅠ酶切4 ～ 6 h，瓊脂糖凝膠電泳回收，備用。使用T4連接酶進行連接實驗，將連接產物轉化DH5α感受態細胞，鋪板、挑菌、擴增并提取質粒，進行PCR和酶切鑒定，測序。

5 細胞培養及轉染 使用添加10%胎牛血清的DMEM培養基培養BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7等細胞，用不含抗生素的DMEM培養基，將細胞種于24孔板(80% ～ 90%密度)中，按照廠商說明書將XREM-Luc和PXRE-Luc，以及內參β-gal質粒轉染相應細胞。轉染相應質粒后的細胞，按照表1中所示藥物濃度梯度處理細胞。對于熒光素酶活性實驗，使用10 μmol/L利福平預處理細胞，再加入酮康唑；對于細胞抑制率實驗，則僅使用化療藥物。

6 XREM-Luc和PXRE-Luc報告基因活性的測定

按照王博等[8]的方法，測定報告基因的螢光素酶活性及內參活性，在此基礎上計算相對活性和抑制率。計算公式：

相對活性(%)=(藥物處理組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)/(藥物最大作用組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)×100%[9]。

藥物作用抑制率(%)=(激動劑處理組報告基因活性-藥物處理組報告基因活性)/(激動劑處理組報告基因活性-溶劑對照組報告基因活性)×100%。

利用Origin 8.5軟件在此基礎上分別計算EC50和IC50值。

7 細胞抑制率實驗 按照張帆等[10]的方法，將腫瘤癌細胞系接種于24孔板中，待每孔細胞密度達到80% ～ 90%換新鮮培養基，每孔1 ml；配置化療藥物工作液，濃度梯度見表2，按照1∶1 000比例加入24孔板中(每孔1 μl)，化療藥物的終濃度見表2。孵育72 h后，每孔加入30 μl CCK-8試劑，孵育4 h后，多功能酶標儀在450 nm 測定吸光度，并計算細胞增殖抑制率。

抑制率(%) = (對照組A 450 nm -藥物處理組A 450 nm)/(對照組A 450 nm -溶劑對照組A 450 nm)×100%。

8 蛋白免疫印跡實驗 按照馮帆等[11]的方法進行實驗，一抗稀釋條件：兔抗人PXR單抗（1∶2 000稀釋）；兔抗人GAPDH內參多抗（1∶5 000稀釋），37℃孵育2 h。硝酸纖維素膜用TBST洗3次，二抗稀釋條件：辣根過氧化物酶-羊抗兔單克隆抗體(1: 5 000稀釋)，室溫孵育1 h。

9 統計學分析 使用統計和繪圖軟件Origin 6.1中的Sigmoidal Fit模塊進行回歸分析，擬合藥物作用的量效曲線并計算相應IC50值和EC50值；使用Origin 6.1軟件中的Polymoidal Fit模塊擬合藥物作用曲線，并計算其R2值和P值。

表1 實驗中工具藥物和化療藥物的濃度梯度設置Tab. 1 Concentrations of compounds used in concentration-response effect test

表2 實驗中化療藥物濃度梯度設置Tab. 2 Concentrations of compounds used in concentration-response effect test

表3 在HepG2細胞中檢測CYP 3A4報告基因活性Tab. 3 Activity of CYP3A4 reporters in HepG2 cell

結 果

1 XREM-Luc和PXRE-Luc報告基因表達載體的構建 XREM-Luc和PXRE-Luc質粒進行菌落PCR鑒定，僅有成功插入XREM(圖1A)及PXRE (圖1B)序列的質粒能夠擴增出PCR條帶；對陽性克隆進行酶切鑒定(圖1C、圖1D)，符合結果預期。

2 XREM-Luc和PXRE-Luc載體的測序鑒定 對前述的陽性克隆進行測序分析，表明所得序列(出示XREM-Luc和PXRE-Luc重組載體中，XREM和PXRE序列中的PXR結合位點)無突變發生。見圖2。

3 XREM-Luc和PXRE-Luc的活性鑒定 PXR的激動劑利福平能夠在HepG2細胞中劑量依賴性地誘導XREM-Luc(R2=0.92；P=0.003 4)和PXRE-Luc (R2=0.95；P=0.011)活性。PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制PXR激動劑利福平誘導的XREM-Luc(R2=0.96；P=0.009 8)和PXRE-Luc(R2= 0.98；P=0.002 2)活性。這表明，構建的CYP 3A4報告基因具有明確的活性。見圖3、表3。

4 化療藥物對XREM-Luc和PXRE-Luc活性誘導作用 PXR在胃癌BGC823、肝癌HepG2、大腸癌LS180、肺癌A549和乳腺癌MCF-7等細胞系中均有表達(圖4)。索拉非尼、吉非替尼、紫杉醇和絲列霉素能夠在BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7細胞中劑量依賴地升高遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因的活性(表4 ～表5)。上述化療藥能夠在PXR陽性的腫瘤細胞內誘導CYP3A4報告基因的活性，其誘導濃度與其作用(殺傷腫瘤細胞)濃度接近。見表6。

圖 1 重組CYP 3A4告基因的PCR和酶切鑒定A ～ B： PCR鑒定結果; C ～ D： 限定性內切酶切鑒定實驗結果; A: XREM-Luc報告基因; B: PXRE-Luc報告基因Fig. 1 Identif i cation of CYP3A4 luciferase reporters via PCR assays and restriction endonuclease experiment A-B: PCR assays; C-D: restriction endonuclease experiment; A: XREM-Luc reporter; B: PXRE-Luc reporter

圖 2 重組PXR 應答元件報告基因的測序鑒定A: XREM-Luc 報告基因; B: PXRE-Luc報告基因Fig. 2 Identif i cation of CYP3A4 luciferase reporters via DNA sequencing A: XREM-Luc reporter; B: PXRE-Luc reporter

圖 3 PXR在GC823、 HepG2、 LS180、 A549和MCF-7細胞中的表達鑒定A: A549轉染XREM-Luc表達載體后使用系列濃度梯度的利福平(PXR激動劑); B: A549轉染PXRE-Luc表達載體后使用系列濃度梯度的利福平; C: A549轉染XREM-Luc表達載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑 (PXR拮抗劑)處理細胞; C: A549轉染XREM-Luc表達載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑處理細胞; D: A549轉染PXRE-Luc表達載體后使用10μmol/L 利福平后，再使用系列濃度梯度的酮康唑處理細胞Fig. 3 Effect of PXR agonist and antagonist on XREM-Luc and PXRE-Luc activity A: A549 cells transfected with XREM-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR); B: A549 cells transfected with PXRE-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR); C: A549 cells transfected with XREM-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR) and Ketoconazole (antagonist of PXR); D: A549 cells transfected with PXRE-Luc and then treated with indicated concentrations of Rifampicin (agonist of PXR) and Ketoconazole (antagonist of PXR)

圖 4 PXR在BGC823、 HepG2、 LS180、 A549和MCF-7細胞中的表達鑒定Fig. 4 Expression of PXR in BGC823, HepG2, LS180, A549 and MCF-7 cells

表4 化療藥物在不同細胞中誘導XREM-Luc報告基因的活性Tab. 4 Activity of XREM-Luc reporter induced by chemotherapeutics

表5 化療藥物在不同細胞中誘導PXRE-Luc報告基因的活性Tab. 5 Activity of PXRE-Luc reporter induced by chemotherapeutics

表6 化療藥物作用于BGC823、HepG2、LS180、A549和MCF-7細胞的IC50值Tab. 6 Cytotoxicity activity of chemotherapeutics on BGC823, HepG2, LS180, A549 and MCF-7 cells

討 論

PXR不僅在消化系統腫瘤中分布廣泛，其下游基因MDR-1編碼和MRP-2/3能夠調控肺癌細胞的化療藥耐受；乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)能夠調控乳腺癌細胞系的化療藥耐受作用[12-13]。此外，PXR下游基因CYPs能夠介導化療藥的氧化代謝，CYP 3A4是最主要的CYPs亞型，能夠介導索拉非尼等分子靶向化療藥物的氧化代謝，影響其化療效果[14]。為研究CYP 3A4的功能以及對化療藥物的影響，本研究構建了CYP 3A4的報告基因遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因。PXR的激動劑利福平能夠劑量依賴性地誘導遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因的活性(表3)；PXR的拮抗劑酮康唑能夠劑量依賴性地抑制利福平誘導的遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因的活性(表3)。這表明本研究成功構建了CYP 3A4報告基因，建立了利用CYP 3A4報告基因檢測PXR轉錄活性的方法。

PXR/CYP3A4在乳腺癌、肝癌等多種腫瘤組織中均有表達。紫杉醇、絲裂霉素和喜樹堿等化療藥以及利福平等抗生素都能夠誘導PXR的活性并介導CYP 3A4和CYP 2B6等型CYPs的表達[1-2]。另有報道稱，多種蛋白激酶抑制劑：吉非替尼、伊馬替尼、拉帕替尼以及舒尼替尼等也能夠誘導PXR的活性[15-17]。因此，藥物代謝系統可能是腫瘤細胞原發性/誘導性多藥耐藥的新作用機制。為此，本研究選取了代表性細胞毒性化療藥物：紫杉醇和絲列霉素，以及小分子蛋白激酶抑制劑索拉非尼和吉非替尼，在PXR表達陽性的乳腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌和胃癌細胞系中檢測其對CYP 3A4報告基因活性的影響(表4 ～表5)。結果顯示，上述藥物均能夠誘導遠端調控序列熒光素酶報告基因和近端調控序列熒光素酶報告基因的活性(表4 ～表5)。進一步，我們得到了上述藥物作用于所選細胞系的IC50值(表6)，發現小分子蛋白激酶抑制劑誘導PXR活性的濃度與其殺傷腫瘤細胞的作用濃度基本相當，而細胞毒性化療藥誘導PXR活性的濃度比其殺傷腫瘤細胞的作用濃度略高。

本研究進一步拓展了對藥物代謝和清除系統調控腫瘤細胞癌化療藥物多藥耐受的認識，對深入理解其分子機制以及化療藥物臨床耐藥的檢測指標具有重要臨床意義；也為今后開發新的腫瘤化藥治療策略提供更多選擇。

1 Glas J， Seiderer J， Fischer D， et al. Pregnane X receptor （PXR/ NR1I2） gene haplotypes modulate susceptibility to inflammatory bowel disease［J］. Inflamm Bowel Dis， 2011， 17（9）： 1917-1924.

2 Krausova L， Stejskalova L， Wang H， et al. Metformin suppresses pregnane X receptor （PXR）-regulated transactivation of CYP3A4 gene［J］. Biochem Pharmacol， 2011， 82（11）： 1771-1780.

3 劉志浩，李燕．核受體對藥物代謝酶和轉運體的調控［J］.藥學學報，2012，47（12）：1575-1581．

4 Istrate MA， Nussler AK， Eichelbaum M， et al. Regulation of CYP3A4 by pregnane X receptor： The role of nuclear receptors competing for response element binding［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2010， 393（4）： 688-693.

5 Thompson PD， Jurutka PW， Whitfield GK， et al. Liganded VDR induces CYP3A4 in small intestinal and colon cancer cells via Dr3 and ER6 vitamin D responsive elements［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 299（5）： 730-738.

6 Kakizaki S， Takizawa D， Tojima H， et al. Xenobiotic-Sensing nuclear receptors CAR and PXR as drug targets in cholestatic liver disease［J］. Curr Drug Targets， 2009， 10（11）： 1156-1163.

7 Wallace BD， Betts L， Talmage G， et al. Structural and functional analysis of the human nuclear xenobiotic receptor PXR in complex with RXRα［J］. J Mol Biol， 2013， 425（14）： 2561-2577.

8 王博，馮帆，張帆，等．LINE-1ORF-1p對ERα陽性乳腺癌細胞的體外影響研究［J］.軍醫進修學院學報，2012，33（7）：763-766．

9 馮帆，龍隆，李微，等．應用高內涵分析技術識別雄激素受體激動劑［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2014，28（1）：42-50.

10 張帆，馮帆，任磊，等．反義核酸藥物癌泰得對乳腺癌細胞株的體外殺傷作用［J］.軍醫進修學院學報，2010，31（4）：370-371．

11 馮帆， 張瓊， 劉洪英， 等. 酪氨酸激酶抑制劑伊馬替尼耐藥K562細胞系的建立及其耐藥特征［J］. 中國藥理學與毒理學雜志，2012， 26（4）： 563-569.

12 Amiri-Kordestani L， Basseville A， Kurdziel K， et al. Targeting MDR in breast and lung cancer： discriminating its potential importance from the failure of drug resistance reversal studies［J］. Drug Resist Updat， 2012， 15（1/2）： 50-61.

13 Poirier A， Portmann R， Cascais AC， et al. The need for human breast cancer resistance protein substrate and inhibition evaluation in drug discovery and development： why， when， and how?［J］. Drug Metab Dispos， 2014， 42（9）： 1466-1477.

14 Ye L， Yang X， Guo E， et al. Sorafenib metabolism is significantly altered in the liver tumor tissue of hepatocellular carcinoma patient［J］. PLoS One， 2014， 9（5）：e96664.

15 Harmsen S， Meijerman I， Maas-Bakker RF， et al. PXR-mediated P-glycoprotein induction by small molecule tyrosine kinase inhibitors［J］. Eur J Pharm Sci， 2013， 48（4-5）：644-649.

16 Yuen MF， Hou JL， Chutaputti A， et al. Hepatocellular carcinoma in the Asia pacific region［J］. J Gastroenterol Hepatol， 2009， 24（3）：346-353.

17 Tanaka M， Katayama F， Kato H， et al. Hepatitis B and C virus infection and hepatocellular carcinoma in China： a review of epidemiology and control measures［J］. J Epidemiol， 2011， 21（6）：401-416.

Construction of CYP 3A4 luciferase reporters and their transcription activity

ZHANG Fan1, SI Wen1, GAO Xudong2, FENG Fan3, WANG Chunping2, YANG Yutao4, YANG Yongping2, YANG Junlan11Department of Medical Oncology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Center for Liver Cancer, 302 Military Hospital of China, Beijing 100039, China;3Department of Pharmacy, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, Liaoning Province, China;4Beijing Institute for Neuroscience, Beijing 100071, China

s: YANG Yongping. Email: yongpingyang@hotmail.com; YANG Junlan. Email: yangjunlan1123@126.com

Objective To construct the cytochrome P-450 (CYP) 3A4 luciferase reporters and test their transcription activity in the positive tumor cells expressed by pregnane X receptor (PXR). Methods The sequences of XREM (-7836/-7208) and PXRE (-362/+52) in CYP 3A4 promoter were amplif i ed via PCR method, and then they were cloned into pGL3-Promoter vectors. The activity of CYP 3A4 reporters was measured by luciferase assay. Results The Rifampicin, which was the agonist of PXR, induced the activity of XREM-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) and PXRE-Luc (R2=0.95; P=0.011) in a dose dependent manner, with the EC50value of 5.65±0.58 μmol/L and 8.91±1.12 μmol/L, respectively. The Ketoconazole, which was the antagonist of PXR, inhibited the activity of XREM-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) and PXRE-Luc (R2=0.92; P=0.003 4) induced by Rifampicin in a dose dependent manner, with the IC50value of 0.55±0.08 μmol/L and 0.94±0.14 μmol/L, respectively. In addition, the effect of some potential PXR's ligands on CYP 3A4 reporters could be examined in the cells expressed by PXR. Conclusion The construction of the CYP 3A4 reporters is successfully established, which lays foundation for further functional study of CYP 3A4.

cytochrome P-450 3A4; pregnane X receptor; luciferase reporters gene; transcriptional activity

R 73-3

A

2095-5227(2015)02-0160-06

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.02.018

時間：2014-10-11 16:51

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141011.1651.003.html

2014-08-12

國家科技重大專項項目(2012ZX1002D2DD；2013ZX100 05002)；國家自然科學基金項目(81272330；81202362)

Supported by the National Science and Technology Major Project (2012ZX 1002D2DD; 2013ZX10005002); National Natural Science Foundation of China (81272330; 81202362)

張帆，女，博士，主治醫師。研究方向：腫瘤學。Email: zfzhangfan10@126.com

楊永平，男，碩士，主任醫師，主任。Email: yongping yang@hotmail.com；楊俊蘭，女，碩士，主任醫師。Email: yangjunlan 1123@126.com