國產外周全血γ干擾素實驗對肺結核病的診斷價值

閆 鵬，任飛霏，蘇龍翔，肖 坤，賈艷紅，趙志銳，陳 勇，張有江，解立新解放軍總醫院 呼吸科，北京 0085；協和醫院 重癥醫學科，北京 000；解放軍總醫院海南分院 呼吸科，海南三亞 570；解放軍總院 微生物科，北京 0085

國產外周全血γ干擾素實驗對肺結核病的診斷價值

閆 鵬1，任飛霏1，蘇龍翔2，肖 坤1，賈艷紅3，趙志銳1，陳 勇3，張有江4，解立新1
1解放軍總醫院 呼吸科，北京 100853；2協和醫院 重癥醫學科，北京 100140；3解放軍總醫院海南分院 呼吸科，海南三亞 572013；4解放軍總院 微生物科，北京 100853

目的探討國產酶聯免疫吸附試驗法檢測結核特異性細胞免疫反應(簡稱A.TB檢測)對肺結核病的診斷價值。方法2013年5 - 11月在解放軍總醫院海南分院就診的疑似肺結核患者326例，均進行A.TB檢測，排除資料不全和最終不能確診病例，共318例納入分析，其中確診肺結核患者89例，回顧性分析A.TB對于肺結核病診斷的價值。結果在確診為肺結核的89例患者中，涂陽28例，其中經A.TB檢測陽性20例，陽性率為71.4%；涂陰61例，其中經A.TB檢測陽性45例，陽性率為73.8%。對于確診為肺結核中的涂陽患者、涂陰患者及非結核患者，A.TB的濃度呈明顯降低趨勢，且差異有統計學意義(χ2=97.360，P=0.001)。涂陽與涂陰患者的A.TB濃度水平均明顯高于非結核患者(P=0.001)。入組患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.816(P=0.001)，敏感性為71.9%，特異性為86.1%；涂陽患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.762(P=0.001)，敏感性為71.4%，特異性為87.8%；涂陰患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.841(P=0.001)，敏感性為72.1%，特異性為86.5%。結論國產A.TB可以作為肺結核病的輔助診斷手段。

肺結核；γ干擾素釋放試驗；臨床實驗室技術

結核病是嚴重威脅人類健康的傳染病之一。近年來，結核病的發病率有上升趨勢。結核菌可侵犯全身各個系統，導致臨床表現復雜多變，尤其是肺外結核常因病情隱匿或表現不典型，極易誤診、漏診[1]。臨床用于診斷結核的方法有限，因此發展快速而敏感的實驗室診斷技術十分重要。目前國內外常用的是γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)。該實驗有兩種不同檢測方法，即酶聯免疫吸附試驗和酶聯免疫斑點試驗。酶聯免疫吸附試驗法即檢測結核特異性細胞免疫反應(簡稱A.TB檢測)，為一種新的γ干擾素釋放試驗的方法，由于其經濟、快捷、方便的特點，近幾年在國內臨床診斷中被越來越多地使用。本文擬探討國產A.TB對肺結核病患者的診斷價值，為臨床醫生診斷結核提供參考依據。

對象和方法

1 研究對象 2013年5 - 11月在解放軍總醫院海南分院就診的臨床懷疑肺結核患者326例，行A.TB檢查，排除資料不全或最終不能確診病例，共納入分析318例檢測A.TB的患者。

2 肺結核診斷標準 1)涂陽：標本中涂片可見分枝桿菌或培養為陽性的細菌，鑒定后為結核分枝桿菌；2)涂陰：3次痰涂片及1次痰培養陰性的肺結核，其診斷標準為：①典型肺結核臨床癥狀和胸部X線表現；②抗結核治療有效；③臨床可排除其他非結核性肺部疾病；④結核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative tuberculin，PPD)(5TU)強陽性；血清抗結核抗體陽性；⑤痰結核菌PCR+探針檢測陽性；⑥肺外組織病理證實結核病變；⑦肺泡灌洗液檢出抗酸分枝桿菌；⑧支氣管或肺組織病理學證實結核病變；具備①～⑥中的3項或⑦～⑧中任何1項可確診。

3 分組 納入分析的318例患者，確診為肺結核病患者(包括涂陽、涂陽患者)為結核組，確診為非結核病患者為非結核組。

4 樣本采集機實驗室檢測 入選病例均采集5 ml肝素鈉抗凝的靜脈全血，室溫保存。應用結核特異性細胞免疫反應監測(ELISA法，簡稱A.TB檢測)試劑盒(海口維瑅瑗生物研究院產品，批號：201011001)檢測A.TB濃度。檢測流程：采血16 h內分別用陰性刺激、陽性刺激和抗原刺激，37℃22～24 h后收集血漿，檢測γ干擾素含量。結果判定：參照A.TB試劑盒說明書，當陰性刺激劑＜500 IU/L、抗原-陰性刺激劑/陽性刺激劑-陰性刺激劑≥0.60時或陰性刺激劑≥500 IU/L、抗原-陰性刺激劑／陽性刺激劑-陰性刺激劑≥0.85時，均判定為陽牲，否則為陰性。

5 統計學處理 采用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析，計量資料采用±s表示，兩組之間比較采用χ2分析。對于非正態或方差不齊的數據，使用中位數(四分位數間距)描述，并應用秩和檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。利用受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計算A.TB對肺結核的診斷效能和曲線下面積，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況 在納入分析的318例中，89例為確診肺結核病例。結核組中涂陽患者28例，A.TB濃度檢測陽性20例，陽性率為71.4%；涂陰患者61例，A.TB濃度檢測陽性45例，陽性率為73.8%。結核組與非結核組比較，單核細胞計數和A.TB濃度在結核組中均數更大，且兩組差異有統計學意義(P=0.001，P=0.001)，A.TB濃度的陽性率比較，差異有統計學意義(χ2=82.126，P=0.001)；結核組中，涂陽患者和涂陰患者比較，A.TB濃度差異無統計學意義(P=0.074)，A.TB濃度的陽性率比較，差異無統計學意義(χ2=0.053，P=0.817)。見表1。

2 不同分組之間A.TB的濃度比較 涂陽患者、涂陰患者、非結核患者A.TB濃度呈明顯降低趨勢，且差異有統計學意義(χ2=97.360，P=0.001)。3組之間兩兩比較發現，涂陽與涂陰患者的A.TB濃度均明顯高于非結核組患者(P=0.001)。盡管涂陽患者的A.TB濃度高于涂陰患者，但是兩者無統計學差異(P=0.839)。見圖1。

圖 1 不同分組之間A.TB濃度比較Fig. 1 Comparison of A.TB concentration between different groups

3 A.TB對于肺結核診斷的準確率 所有患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.816(P=0.001)，敏感性為71.9%，特異性為86.1%，準確率為78.31%；涂陽患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.762(P= 0.001)，敏感性為71.4%，特異性為87.8%，準確率為78.99%；涂陰患者A.TB濃度的ROC曲線下面積為0.841(P=0.001)，敏感性為72.1%，特異性為86.5%，準確率為78.63%。即A.TB對涂陽結核患者的特異性最好，準確率最高，對涂陰患者診斷的敏感性最好。A.TB濃度對于肺結核診斷的陽性預測值為58.93%，陰性預測值為88.83%，對于涂陰患者陰性預測值91.96%，遠大于陽性預測值。A.TB濃度的陽性似然比＞5，陰性似然比＜1，說明A.TB濃度的高低對于結核診斷有增強作用。見表2和圖2。

表1 疑似肺結核患者的基本資料Tab. 1 Basic information of suspected pulmonary tuberculosis patients

表2 A.TB濃度對于不同分組的敏感性、特異性的比較Tab. 2 Comparison of A.TB concentration on the sensitivity and specificity of different groups

圖 2 應用ELISA方法，A.TB(ELISA法)對肺結核診斷效率的ROC曲線 A： PTB； B： SPPT； C： SNPTFig. 2 ROC curve of A.TB in patients with suspected tuberculosis by ELISA A: PTB; B: SPPT; C: SNPT

討 論

臨床中診斷結核存在很大的困難，傳統的結核診斷方法敏感性和特異性都很差[2-3]。痰涂片和痰培養尋找結核分枝桿菌敏感性極差，但具有較高的特異性，雖然被認為是診斷金標準，但是過長的培養時間和涂陰結核患者的存在，導致臨床中肺結核的漏診率非常高[4-5]。結核菌素皮膚試驗(the tuberculin test，TST)是最經典的診斷結核的方法，它的局限性是診斷的不確定性和對于個體注射卡介苗的患者或其他分枝桿菌感染患者的假陽性率很高，因其較差的特異性和太高的敏感性，在目前的指南中不推薦應用TST作為結核病的診斷方法[6-7]。

國內外目前最常用的結核輔助診斷方法是γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assay，IGRA)，該實驗目前有兩種不同方法，即酶聯免疫吸附試驗和酶聯免疫斑點試驗。IGRA的原理是使用兩種特異性抗原，不受卡介苗接種和非結核分枝桿菌感染的影響，在結核感染(包括活動性結核病和潛伏期感染)中的診斷價值較高[8-10]。國產IGRA/ELISA診斷產品A.TB使用的是抗原特異性激活的細胞免疫技術，該技術是一種全新的抗原遞呈系統，與靶抗原融合修飾后，可在大腸埃希菌中規模化制備重組T細胞抗原，這種抗原可以全長進入抗原呈遞細胞的細胞質中，參與主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex MHC)加工呈遞途徑，激活T細胞，在體內和體外均有參與細胞免疫的能力[11]。理論上認為，A.TB檢測的是外周血淋巴細胞群體對特異性抗原刺激的應答水平，而ELISPOT檢測是單細胞水平的應答，這也是ELISA方法較ELISPOT方法的優勢之一。

在兩種IGRA中，以ELISA技術為代表的是QFT-GIT，以ELISPOT技術為代表的是T-SPOT。而更多的Meta分析表明，ELISA和ELISPOT檢測方法的敏感性和特異性的差異無統計學意義[12-14]，而在中低收入的國家中，非HIV感染患者中涂陰患者的QFT-GIT和T-SPOT的敏感性和特異性分別為69%和83%、52%和61%[9,15]。本研究中，所有患者中A.TB整體的敏感性為71.9%，特異性為86.1%，與文獻報道的兩種不同方法對結核病診斷的敏感性、特異性較為一致，而類似的研究國內曾有報道[16]。這些均充分說明該方法的穩定性，其可以用于結核的診斷。

本研究中，涂陽患者、涂陰患者、非結核患者A.TB的濃度呈明顯降低趨勢，且差異有統計學意義(χ2=97.360，P=0.001)。3組之間兩兩比較發現，涂陽與涂陰患者的A.TB水平均明顯高于非結核患者(P=0.001)。盡管涂陽患者的A.TB濃度高于涂陰患者，但是兩者無統計學差異(P=0.839)。因此，在應用A.TB診斷結核過程中，A.TB的濃度越高，診斷為結核的可能性越大。而且A.TB對涂陽結核患者的特異性最好，對涂陰患者診斷的敏感性最好。A.TB濃度對于肺結核診斷的陽性預測值為58.93%，陰性預測值為88.83%，對于涂陰患者陰性預測值91.96%，遠大于陽性預測值，即A.TB濃度在結核排除診斷中價值更高，尤其是對混合感染或免疫抑制患者是否合并結核感染時。A.TB濃度的陽性似然比為5.33，陰性似然比為0.32，對結核診斷有增強作用，但不明顯。上述結論與WHO最新頒布的指南結論相同[7,17]。

本研究中應用ELISA方法測定γ干擾素的濃度，而A.TB在檢測之前需要留置16 h再行檢測。實際臨床檢測中，因各個臨床科室的抽血時間不可能完全一致，進而導致檢測時留置時間不同，影響A.TB檢測濃度。這也是本研究中存在的問題。

總之，IGRA為我們提供一種提高結核診斷率的方法，它雖然不能代替痰涂片和痰培養等金標準，但是越來越多的證據證明，對于涂陰和培陰患者，IGRA能明顯提高診斷效率[18-20]。歐洲疾病預防和控制中心、世界衛生組織推薦在中低收入的國家以及HIV感染患者中，應用IGRA協助診斷結核[15,17,21]。由于IGRA/ELISA方法不需要人工判讀，較IGRA/ELISPOT方法減少了人工誤差，不存在不確定性[22-23]，同時A.TB價格較QFT-GIT便宜，因此可以得到很好的臨床推廣。

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Diagnostic value of domestic peripheral blood gamma interferon experiment for pulmonary tuberculosis

YAN Peng1, REN Feifei1, SU Longxiang2, XIAO Kun1, JIA Yanhong3, ZHAO Zhirui1, CHEN Yong3, ZHANG Youjiang4, XIE Lixin1
1Department of Respiratory, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Department of Critical Care Medicine, Peking Union Medical College Hospital, Beijing 100140, China;3Department of Respiratory, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya 572013, Hainan Province, China;4Division of Microbiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XIE Lixin. Email: xielx@263.net

ObjectiveTo explore the domestic ELISA assay for detecting specific cellular immune response to tuberculosis (A.TB test) in the diagnosis of tuberculosis patients.MethodsOf the 326 patients with suspected pulmonary tuberculosis who were checked with A.TB in Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital from May 2013 to November 2013, 318 patients were involved in this trial with excluding the data incomplete and ultimately unconfirmed cases. A.TB value for pulmonary tuberculosis diagnosis in 89 patients who were diagnosed as tuberculosis was retrospectively analyzed.ResultsOf the 89 cases with pulmonary tuberculosis, 28 cases were smear-positive, including 20 cases being positive detected by A.TB test with the positive rate of 71.4%; 61 cases were smear-negative patients, including 45 cases being positive detected by A.TB test with the positive rate of 73.8%. For patients in the diagnosis of pulmonary tuberculosis with smear-positive, smear-negative and patients in the diagnosis of non tuberculosis, A.TB concentration showed a trend of decrease with significant difference between each other (χ2=97.360, P=0.001). The A.TB concentration average levels of smear positive and smear negative were significantly higher than that of non tuberculosis (P=0.001). ROC curve area of the 89 patients with A.TB concentration was 0.816 (P=0.001) with the sensitivity of 71.9% and the specificity of 86.1%; ROC curve area of smear positive patients with A.TB concentration was 0.762 (P=0.001) with the sensitivity of 71.4% and the specificity of 87.8%; ROC curve area of smear negative patients with A.TB concentration was 0.841 (P=0.001) with the sensitivity of 72.1% and the specificity of 86.5%.ConclusionDomestic A.TB can be used as an auxiliary diagnosis method for pulmonary tuberculosis.

phthisis; γ interferon release assay; clinical laboratory techniques

R 521

A

2095-5227(2015)03-0258-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.016

時間：2014-12-09 09:57

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141209.0957.001.html

2014-09-11

閆鵬，男，碩士。研究方向：呼吸與危重癥，呼吸康復治療。Email: yanpeng301@163.com；共同第一作者：任飛霏，女，碩士。研究方向：呼吸與危重癥。Email: fresh198112@sohu.com

解立新，男，博士，碩士生導師。Email: xielx@263.net