水浴降溫與室溫降溫對熱打擊大鼠肺組織損傷及預后影響比較

楊文超，高鐵嬰，胡 婕，李瑞生，宋 青解放軍總醫院 重癥醫學科，北京 00853；解放軍第30醫院 動物實驗中心，北京 00039

基礎研究論著

水浴降溫與室溫降溫對熱打擊大鼠肺組織損傷及預后影響比較

楊文超1，高鐵嬰1，胡 婕1，李瑞生2，宋 青1
1解放軍總醫院 重癥醫學科，北京 100853；2解放軍第302醫院 動物實驗中心，北京 100039

目的研究冰水浴、常溫水浴、室溫降溫對熱打擊(heat stress，HS)大鼠死亡構成比、肺組織病理及相關細胞因子水平的影響。方法115只雄性SD大鼠隨機分為肺損傷觀察組(n=70)和死亡率分析組(n=45)。肺損傷觀察組隨機分為空白對照(normothermic contral，NC)組(n=10)和熱打擊(room temperature，RT)組(n=60)，NC組始終置于室溫環境，HS組大鼠麻醉后置于高溫高濕模擬環境，核心體溫達42℃后，隨機分為室溫降溫組(n=20)，常溫水浴降溫(temperate-water immersion，TWI)組(n=20)，冰水浴降溫(ice water immersion，IWI)組(n=20)，分別給予相應降溫方法降溫。同時，將3組大鼠分別隨機分為熱打擊后15 min處死組(n=10)和3 h處死組(n=10)。各組大鼠在相應時間點處死，HE染色觀察肺組織病理改變，Elisa檢測肺組織勻漿相關細胞因子水平。死亡率分析組隨機分為HS + RT組、HS + TWI組、HS + IWI組，統計熱打擊后3 h死亡構成比。結果與HS + RT組相比，HS + TWI組和HS + IWI組大鼠死亡構成比顯著降低(χ2=10.601，P=0.001)。HS + IWI 3 h組肺組織出現間質水腫、出血，肺泡萎縮塌陷、腔內出血，促炎因子TNF-α水平高于NC組(P＜0.05)及對應TWI組、RT組(P＜0.05)。結論TWI、IWI較RT顯著改善熱打擊大鼠預后，但IWI誘發更為嚴重的肺組織損傷，提示目前的水浴溫度、水浴時長等可能不是最優的。

熱打擊；冰水浴降溫；肺；炎癥；大鼠

熱射病是機體暴露在高溫、高濕環境中，核心體溫(core temperature，Tc)迅速升高(通常＞40℃)伴中樞神經系統癥狀為主要特征的致命性急癥，發病后迅速出現全身炎性反應及多器官功能障礙[1-3]，病死率可達40%[4]。75%熱射病患者合并多器官功能障礙，其中87.5%出現呼吸衰竭，主要表現為急性呼吸窘迫綜合征[3,5]。動物實驗證明，熱打擊(heat stress，HS)后大鼠肺組織出現急性炎癥反應[3,6-7]。迅速降溫和器官功能支持是熱射病的兩個主要治療原則[1]。將體溫在30 min內降至40℃以下至關重要，為熱射病治療的“黃金半小時”。快速降溫的金標準為冷水浴降溫(cold water immersion，CWI)(1.7～14.0℃)，其中4℃以下水浴降溫又稱冰水浴降溫(ice water immersion，IWI)。臨床上也有使用常溫水浴降溫(temperate-water immersion，TWI)(20～26℃)的報道[8]。但水浴降溫對熱打擊后肺組織損傷的影響國內外尚無詳盡報道。本實驗通過比較冰水浴、常溫水浴、室溫降溫對熱打擊大鼠死亡構成比、肺組織病理及相關細胞因子水平的影響，探討水浴降溫對熱打擊致急性肺損傷的作用效果。

材料和方法

1 實驗動物 健康雄性Sprague-Dwley大鼠115只，12～14周齡，體質量(210±20) g，SPF級，由解放軍第302醫院提供。分籠適應性飼養3 d(動物合格證書編號：軍動管字第2014022191號)，溫度(23±1)℃，濕度40%±5%，燈光照明，12 h晝夜節律變化。遵守實驗動物倫理原則，關注動物福利，盡可能減少對動物的損害。

2 主要儀器和試劑 自制熱環境仿真模擬艙，動物肛溫表，定時秒表，控溫毯，離心機，電動勻漿器，生物組織包埋機，組織切片機，EP管。4%多聚甲醛，二甲苯，無水乙醇，95%、85%、75%及60%乙醇，蒸餾水，蘇木精染液，伊紅染液，PBS液，苯甲基磺酰氟，BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime)，ELISA檢測試劑盒(NeoBioscience)：轉化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)(ERC107b.96)，白細胞介素10(interleukin-10，IL-10)(ERC004.96)，腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)(ERC102a.96)，IL-6 (ERC003.96)。

3 實驗分組與熱打擊模型制備 實驗前12 h禁食不禁水，實驗動物按隨機數字表法隨機分為肺損傷觀察組(n=70)和死亡率分析組(n=45)。肺損傷觀察組再隨機分為空白對照(normothermic control，NC)組(n=10)和HS組(n=60)，NC組始終置于室溫環境[溫度(23±1)℃，濕度40%±5%]。HS組大鼠10%水合氯醛2 ml/kg腹腔麻醉后，俯臥置于溫度(37.5±0.5)℃、濕度65%±5%的模擬環境[9-10]，核心體溫達到42℃建立熱打擊模型后[11]，從模擬環境中取出并隨機分為3組，立即使用相應降溫方法進行降溫：室溫降溫(room temperature，RT)組(n=20)置于室溫降溫，TWI組(n=20)置于(21±1)℃水浴降溫，IWI(n=20)置于(3±1)℃水浴降溫，降至熱打擊前核心體溫后使用控溫毯維持體溫。同時，將3組大鼠分別隨機分為熱打擊后15 min處死組和3 h處死組兩個亞組，記為HS + RT 15 min組(n=10)，HS + RT 3 h組(n=10)，HS + TWI 15 min組(n=10)，HS + TWI 3 h組(n=10)，HS + IWI 15 min組(n=10)，HS + IWI 3 h組(n=10)。死亡率分析組隨機分為HS + RT組(n=15)、HS + TWI組(n=15)、HS + IWI組(n=15)，造模及降溫方法同上，觀察熱打擊后3 h大鼠存活情況并統計死亡構成比。

4 核心體溫監測 使用動物肛溫表測量肛溫作為核心體溫(℃)，Tc＜41℃時，每15 min測量1次；Tc＞41℃時，每5 min測量1次，直至造模成功，記錄造模時間(min)。計算各降溫方法降溫速率(υ，℃/min)，IWI及TWI公式：

5 HE染色 各組大鼠均在10%水合氯醛麻醉下頸動脈取血處死，取左肺于4%多聚甲醛灌注固定。切取3 mm×3 mm×2 mm組織塊，60%乙醇過夜、75%乙醇50 min、85%乙醇50 min、95%乙醇50 min、無水乙醇50 min (2次)脫水。二甲苯30 min (2次)透明，65℃恒溫下浸蠟20 min (2次)。包埋后行5μm切片，而后行蘇木精-伊紅染色，光學顯微鏡下觀察并照相。

6 肺組織TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β檢測剪取適量右肺下葉同一區域組織至2 ml EP管，加入500μl遇冷PBS，加至終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟，電動勻漿器勻漿10 s×3次，冰上放置20 min，4℃、15 000 r/min離心20 min。離心后，收集上清液，BCA蛋白定量測定各樣本蛋白濃度，用PBS將各樣本蛋白調整為蛋白濃度一致(5 mg/ ml)，Elisa檢測TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β濃度。

結 果

1 熱打擊模型大鼠一般情況 各組大鼠體質量、造模前Tc、造模成功Tc、造模時間差異均無統計學意義。HS + TWI 15 min組、HS + IWI 15 min組均在熱打擊后15 min內降至熱打擊前Tc(υTWI=0.34± 0.04，υIWI=0.55±0.06)，而HS + RT 15 min組在處死時未能降至熱打擊前Tc(υRT=0.14±0.05)。IWI降溫速率大于TWI(P＜0.05)，TWI降溫速率大于RT(P＜0.05)。見表1。

2 肺組織病理 HS + RT 15 min組、HS + RT 3 h組、HS + TWI 15 min組、HS + TWI 3 h組、HS + IWI 15 min組出現肺間質毛細血管擴張、間質增寬；HS + IWI 3 h組可見肺間質增寬、水腫、出血，肺泡萎縮塌陷、腔內出血。各組均未見明顯的中性粒細胞浸潤。見圖1。

3 肺組織TGF-β、IL-10變化 HS + RT 15 min組、HS + TWI 15 min組、HS + IWI 15 min組TGF-β、IL-10水平高于NC組(P＜0.05)；HS + TWI 15 min組、HS + IWI 15 min組TGF-β、IL-10水平低于HS + RT 15 min組(P＜0.05)；HS + IWI 15 min組TGF-β、IL-10水平高于HS + TWI 15 min組(P＜0.05)。HS + RT 3 h組、HS + TWI 3 h組、HS + IWI 3 h組TGF-β、IL-10水平低于NC組(P＜0.05)及其對應15 min組(P＜0.05)；HS + TWI 3 h組、HS + IWI 3 h組TGF-β、IL-10水平高于HS + RT 3 h組(P＜0.05)；HS + IWI 3 h組TGF-β水平高于HS + TWI 3 h組(P＜0.05)；HS + IWI 3 h組IL-10水平低于HS + TWI 3 h組(P＜0.05)。見圖2。4 肺組織TNF-α、IL-6水平變化 HS + TWI 15 min組、HS + IWI 15 min組TNF-α水平高于NC組和HS + RT 15 min組(P＜0.05)；HS + IWI 15 min組高于HS + TWI 15 min組(P＜0.05)；HS + RT 15 min組與NC組TNF-α水平差異無統計學意義(P＞0.05)。HS + RT 3 h組、HS + TWI 3 h組、HS + IWI 3 h組TNF-α水平高于NC組(P＜0.05)及相應15 min組(P＜0.05)；HS + TWI 3 h組、HS + IWI 3 h組高于HS + RT 3 h組(P＜0.05)；HS + IWI 3 h組高于HS + TWI 3 h組(P＜0.05)。各組IL-6水平差異均無統計學意義(P＞0.05)。見圖2。

圖 1 各組大鼠肺組織病理改變 (HE×800)Fig. 1 Histological examination of lung tissues of rats in each group (HE×800)

表1 各組大鼠體質量、核心體溫、造模時間、降溫速率比較Tab. 1 Comparison of weight, Tc, time of HS, cooling rate of rats in each group (±s)

表1 各組大鼠體質量、核心體溫、造模時間、降溫速率比較Tab. 1 Comparison of weight, Tc, time of HS, cooling rate of rats in each group (±s)

Tc: core temperature; υ: cooling rate; NC: normothermic control; HS: heat stress; RT: room temperature; TWI: temperate-water immersion; IWI: ice water immersion; 15 min: 15 minutes after heat stress; 3 h: 3 hours after heat stress.aP＜0.05, vs HS + RT;bP＜0.05, vs HS + TWI

圖 2 水浴降溫對大鼠肺組織TGF-β、 IL-10、 TNF-α、 IL-6的影響Fig. 2 Effects of water immersion on TGF-β, IL-10, TNF-α, IL-6 levels in lung homogenate HS: heat stress; RT: Room temperature; TWI: Temperate-water immersion; IWI: Ice-water immersion; NC: normothermic control; 15 min: 15 minutes after heat stress; 3 h: 3 hours after heat stress.aP＜0.05, vs NC;bP＜0.05, vs HS + RT at the same time point (15 min or 3h);cP＜0.05, vs HS + TWI at the same time point;dP＜0.05, vs 15 min with the same cooling treatment (RT; TWI; or IWI)

5 各降溫方法死亡構成比比較 熱打擊后3 h，HS + RT組大鼠死亡6只，死亡構成比40%，死亡大鼠口唇、舌、鼻尖及四肢末端紫紺。HS + TWI組、HS + IWI組均無大鼠死亡，合并記為HS + WI組，死亡構成比為0，與HS + RT組比較差異有統計學意義(χ2=10.601，P=0.001)。見表2。

表2 各降溫方法大鼠死亡構成比比較Tab. 2 Constituent ratio of death of rats in different cooling treatments (n, %)

討 論

目前認為，決定熱射病預后最重要的因素為體溫高于危險極值的時長，體溫在30 min內降至40℃以下的患者均可存活[8,12]。有研究表明，CWI(1.7～14.0℃)可在20 min內將體溫(＞43.3℃)降至40℃以下[13]。本實驗中，與RT組相比，TWI及IWI降溫速率增大，且IWI更為明顯；同時，TWI和IWI顯著降低熱打擊大鼠死亡構成比。

TGF-β和IL-10與肺泡巨噬細胞(alveolar macrophage，AM)表面TGF-β受體和IL-10受體結合，抑制AM釋放促炎介質TNF-α、IL-6等[14]。本實驗中，RT、TWI、IWI 15 min組肺組織TGF-β、IL-10水平較NC組顯著升高，RT、TWI、IWI 3 h組肺組織TGF-β、IL-10水平均較其對應15 min組及NC組顯著降低，提示隨著病情發展，各降溫組TGF-β和IL-10對AM的抑制作用減弱。HS + IWI 3 h組肺組織TNF-α水平高于HS + TWI 3 h組和HS + RT 3 h組，且出現肺間質水腫、出血，肺泡萎縮塌陷及腔內出血，故IWI誘發熱打擊大鼠肺部更為嚴重的組織損傷。然而，Yang等[15]建立大鼠熱打擊模型，環境溫度16℃持續降溫2 h的方法觀察肺損傷發現，該方法可緩解熱打擊致肺泡塌陷、間質增寬及炎性細胞浸潤；熱打擊后88 min，與常溫環境組(26℃)相比，支氣管肺泡灌洗液促炎因子TNF-α水平顯著降低。本實驗結果與之相反，可能為降溫過度所致。此外，本實驗各組大鼠肺組織IL-6水平均未出現明顯變化，可能與AM分泌特性及實驗終點時間選取較早有關[16-17]，具體機制還需進一步研究。

目前，關于熱射病救治“金標準”水浴降溫治療尚存爭議。Gagnon等[18]建議使用2℃水浴將患者直腸溫度降至38.6℃后停止降溫。然而，機體突然浸入冰水后，皮膚溫度迅速下降，誘發“冷休克”反應，在核心體溫未發生變化之前出現吸氣性呼吸困難、過度通氣、低碳酸血癥、心動過速、外周血管收縮及高血壓[19]。Taylor等[20]對運動后高熱患者進行水浴降溫研究發現，TWI(26℃)可以減弱CWI(14℃)出現的冷休克反應。本實驗中TWI和IWI均使熱打擊大鼠死亡構成比降為0，但熱打擊后3 h，IWI組肺組織促炎因子TNF-α水平高于TWI組及RT組，并出現明顯間質水腫、出血，肺泡萎縮塌陷、腔內出血，提示IWI在改善熱打擊大鼠預后的同時參與熱打擊早期急性肺損傷發生、發展過程，可能與水浴溫度低和(或)降溫時間長，機體出現冷應激有關；此外，TWI組肺組織促炎因子TNF-α、IL-10水平高于RT組，提示TWI亦可加重肺部炎性反應，因此確定最優水浴溫度、水浴時長并選取最優降溫截點核心體溫的研究有待完善。

本實驗首次報道冰水浴降溫加重熱打擊大鼠肺局部組織損傷，參與熱打擊早期急性肺損傷發生、發展過程。然而，實驗中僅觀察熱打擊前期死亡情況，而肺組織的損傷是否與后期病死率相關，還需進一步觀察。此外，動物實驗并不能完全代替臨床實際，熱射病發病早期關于冷水浴降溫，尤其是冰水浴降溫對肺組織甚至其他臟器影響的研究任重道遠。

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Comparison of effects and prognosis of ice water immersion and room temperature cooling treatments on lung inflammation in heat-induced rats

YANG Wenchao1, GAO Tieying1, HU Jie1, LI Ruisheng2, SONG Qing1
1Department of Critical Care Medicine, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China;2Laboratory Animal Center, Chinese PLA 302 Hospital, Beijing 100039, China

SONG Qing. Email: songqing3010301@sina.com

ObjectiveTo investigate the effects of ice water immersion, temperate-water immersion, and room temperature cooling treatments on constituent ratio of death, histology and related molecules in lungs of heat-induced rats.MethodsOne hundred and fifteen male SD rats were randomly divided into pulmonary injury-analyses group (n=70) and death-analyses group (n=45), and the former group included two groups: normothermic control group (NC, n=10) and heat stress group (HS, n=60). Rats in NC group were put in the room temperature chamber while rats in HS group were put in a folded heating pad with general anesthesia. When their core temperature (Tc) elevated to 42℃, cooling treatments were accomplished via room temperature (RT, n=20), temperatewater immersion (TWI, n=20) and ice water immersion (IWI, n=20). The heated rats in each group were sacrificed at the time of 15 min (n=10) or 3 h (n=10) after heat stress. The lung morphology was analyzed by hematoxylin and eosin staining, and the levels of related cytokines of the lung homogenate were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. The constituent ratio of death in the death-analyses group was calculated 3 h after heat stress in HS+RT group (n=15), HS+TWI group (n=15), and HS+IWI group (n=15).ResultsCompared with HS+RT group, the constituent ratio of death in HS+TWI group and HS+IWI group decreased significantly (χ2=10.601, P=0.001). The heated rats in HS+IWI 3 h group displayed alveolar collapse, edema, hemorrhage and thickened interstitium, and the level of the pre-inflamatory cytokine TNF-α was higher than that of the NC group (P＜0.05) and the related TWI and RT groups (P＜0.05).ConclusionTWI and IWI can improve the prognosis of heat-induced rats, while IWI may aggravate the pulmonary inflammation and cause acute lung injury after heat stress, which suggests that it is necessary to redefine the cooling temperature and cooling time of water immersion.

heat stress; ice water immersion; lung; inflammation; rats

R 594.12

A

2095-5227(2015)03-0262-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.03.017

時間：2014-11-06 10:44

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20141106.1044.003.html

2014-09-03

國家自然科學基金項目(81050005)

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81050005)

楊文超，女，在讀碩士。研究方向：重癥醫學。Email: wenchao66397@163.com

宋青，女，主任醫師，博士生導師。Email: songqing3010301@sina.com