評估無血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性

康 康，王藹明，尹善德，趙 勇，王明凱，黃紹敏解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 00853；海軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 00048

評估無血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的可行性

康 康1,2，王藹明1,2，尹善德2，趙 勇2，王明凱2，黃紹敏1
1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2海軍總醫(yī)院 婦產(chǎn)科，北京 100048

目的使用無血清培養(yǎng)基體外分離擴(kuò)增子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，研究其生物學(xué)特性。方法比較在無血清培養(yǎng)基中和含10%胎牛血清培養(yǎng)基中子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞表型、增殖能力、細(xì)胞活率和分化能力等生物學(xué)特性。結(jié)果無血清培養(yǎng)基和有血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)相似，但是前者呈明顯的漩渦狀生長，更加細(xì)長，立體感更強；無血清和有血清培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物均呈陽性；無血清培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞活率更高、細(xì)胞增殖能力更強。結(jié)論無血清培養(yǎng)基能夠在體外擴(kuò)增子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，并使其生物學(xué)特性(細(xì)胞增殖，細(xì)胞活率)優(yōu)于胎牛血清培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，且分化能力無改變，可以取代胎牛血清用于細(xì)胞治療，避免有血清培養(yǎng)的干細(xì)胞治療引起的人畜共患病及免疫原性反應(yīng)。

子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；分化

子宮內(nèi)膜組織是一種高度再生的組織，在女性育齡期經(jīng)歷超過400次的生長、分化和脫落[1]。子宮內(nèi)膜在每個月經(jīng)周期內(nèi)可以增長約7 mm，其重塑能力是其他器官不能比擬的[2]。子宮內(nèi)膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞是細(xì)胞治療中非常有前景的無創(chuàng)來源。子宮內(nèi)膜干細(xì)胞(endometrium-derived stem cells，EnSCs)首次于2004年從子宮內(nèi)膜組織中分離出來，包括上皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、側(cè)群細(xì)胞、其中間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛，越來越多的證據(jù)表明，子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(endometriumderived mesenchymal stem cells，EnMSCs)可以應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)，其可以作為免疫調(diào)節(jié)劑以減輕炎癥，影響組織再生中血管的生成，也能誘導(dǎo)成為多能干細(xì)胞[3]。目前，關(guān)于EnMSCs培養(yǎng)和分離均是應(yīng)用胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)作為營養(yǎng)來源，F(xiàn)BS成分尚未明確，且有含阮病毒的風(fēng)險，據(jù)文獻(xiàn)報道，市售FBS 20% ～ 50%都含有病毒。除此之外，經(jīng)FBS培養(yǎng)出來的干細(xì)胞內(nèi)含有牛血清蛋白，可以使受者體內(nèi)產(chǎn)生抗牛蛋白抗體，從而引起免疫反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致干細(xì)胞治療作用下降甚至失效。因此，發(fā)現(xiàn)一種高效的培養(yǎng)基，將干細(xì)胞的再生和分化能力保持高效，同時能夠最小化疾病的傳播風(fēng)險，勢在必行[4]。目前，無血清培養(yǎng)基已經(jīng)應(yīng)用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[5-6]、臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[7-8]和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[9-10]，但是應(yīng)用于子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞至今未見報道。我們用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)EnMSCs，從形態(tài)、增殖、分化以及表面標(biāo)記物的活率來判斷無血清培養(yǎng)基是否可以應(yīng)用于子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)。

材料和方法

1 樣品來源 子宮內(nèi)膜標(biāo)本取自海軍總醫(yī)院2014年1 - 6月因子宮肌瘤、CINⅢ、宮頸癌而行子宮切除術(shù)的10位患者，均為育齡期女性，年齡31 ～50歲，術(shù)前3個月未服用過激素類藥物。組織均取自遠(yuǎn)離患處，標(biāo)本包含5 mm肌層的子宮內(nèi)膜全層，獲取子宮內(nèi)膜組織后，立即用無菌0.9%氯化鈉注射液沖洗，置入10 ml無菌冰冷IMDM培養(yǎng)液(含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)中，1 h內(nèi)送京蒙高科干細(xì)胞實驗室培養(yǎng)[11]。所有子宮內(nèi)膜均經(jīng)病理檢查，排除子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜炎性病變、子宮內(nèi)膜惡性病變等，且證實為增殖期或分泌期子宮內(nèi)膜。標(biāo)本留取經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，征得患者同意并簽署知情同意書。

2 試劑與儀器 IMDM培養(yǎng)基及試劑購于Gibico公司，MesenCult-XF購于Stem cell公司，CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABC-FITC全部購于BD公司。CCK-8試劑盒購于Dojindo公司。

3 細(xì)胞的原代培養(yǎng) 樣本送至實驗室后，在平衡鹽溶液中反復(fù)洗滌至去除紅細(xì)胞，將標(biāo)本剪成5 mm3小塊，置于50 ml離心管中，加入5 ～ 10 ml濃度為0.25%的胰酶，于37℃水浴箱中消化30 min，10 mg/ml胰酶抑制劑中和胰酶活性。以2 000 r/min離心8 min，并用0.9%氯化鈉注射液清洗兩次，加入5 ～ 10 ml濃度為0.1%的膠原酶Ⅰ消化1 h，以1 500 r/min離心8 min，并清洗兩次，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)體系(serum-free medium，SFM)為化學(xué)成分明確的商用無動物源成分的培養(yǎng)基，有血清培養(yǎng)體系(serumcontaining medium，SCM)含有10%的IMDM。72 h后更換培養(yǎng)基，之后每周更換2次。子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞于每一代傳代前由倒置顯微鏡進(jìn)行拍照記錄。

4 EnMSCs流式細(xì)胞分析 細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時分別進(jìn)行免疫表型分析，鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。用0.125%胰酶EDTA鈉溶液消化采集細(xì)胞，離心，棄去上清，用PBS以1×106的密度重懸，分別向預(yù)加好抗體CD13-FITC、CD29-APC、CD44-PE、CD90-FITC、CD14-APC、CD19-APC、CD34-PE、CD45-FITC、CD73-PE、CD105-PercP、CD166-PE、HLA-DR-APC、HLA-ABCFITC的FALCON管各加100μl細(xì)胞懸液，Mouse lgG1-FITC，Mouse lgG1-APC，Mouse lgG1-PE，Mouse lgG1-PercP做陰性對照。在3 h內(nèi)上機檢測。EnMSCs細(xì)胞活率測定用0.125%胰酶EDTA鈉溶液消化采集細(xì)胞，1 500 r/min，5 min，離心，棄上清，7-AAD抗體加2μl/test，立即上機檢測。

5 EnMSCs細(xì)胞生長曲線測定 將第3代細(xì)胞分別以1 000/孔的密度接種到96孔板中，重復(fù)種植4個96孔板，分別檢測1 ～ 8 d細(xì)胞的增殖，并設(shè)置空白對照組，450 nm條件下檢測吸光度值。用酶標(biāo)儀檢測，以時間為橫坐標(biāo)，每組細(xì)胞平均吸光度為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。

6 EnMSCs成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化 1)成脂分化取第3代細(xì)胞，3×104/孔接種于12孔板中。待細(xì)胞達(dá)到70% ～ 80%融合時，分別吸去培養(yǎng)基，加入成脂分化培養(yǎng)基，每隔2 ～ 3 d更換新鮮的成脂分化培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)3周后，進(jìn)行油紅O油滴染色。成脂分化培養(yǎng)基在含IMDM培養(yǎng)基中補充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、12 mmol/L L-谷氨酰胺、10 μmol/L胰島素(Sigma公司)、200 μmol/L 吲哚美辛(Sigma公司)、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX，Sigma公司)。2)成骨分化取第3代細(xì)胞，3×104/孔接種于12孔板中。待細(xì)胞達(dá)到70% ～ 80%融合時，分別吸去培養(yǎng)基，加入成骨分化培養(yǎng)基，每隔2 ～ 3 d換液新鮮的成脂分化培養(yǎng)基。分化誘導(dǎo)3周后，用茜素紅進(jìn)行油滴染色。成骨分化培養(yǎng)基低糖IMDM培養(yǎng)基中補充有10%胎牛血清、100 μmol/L抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鹽和100mmol/L地塞米松(Sigma公司)。3)成軟骨分化取第3代細(xì)胞，將P3代細(xì)胞按照5×105/ml的量加入成軟骨分化培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吸取10μl滴到6孔板上，放置24 h，24 h后加入新鮮的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，分化誘導(dǎo)3周后，用阿利信藍(lán)染色。成軟骨分化培養(yǎng)基IMDM培養(yǎng)基中補充有10%胎牛血清、1 μmol/L地塞米松、2 ml ITS和10 ng/ml TGF-β3(Sigma公司)。7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析，計量資料用表示。組間差異采用雙尾t檢驗和方差分析測試進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EnMSCs貼壁細(xì)胞的形態(tài)及傳代 子宮內(nèi)膜細(xì)胞分別用SFM和SCM接種24 ～ 72 h后貼壁，倒置顯微鏡下觀察呈現(xiàn)梭形；72 h后全量換液去除未貼壁的組織和細(xì)胞，此時細(xì)胞多呈長梭形和紡錘形，此后貼壁細(xì)胞迅速增殖，細(xì)胞集落明顯增大、增多。經(jīng)過傳代，細(xì)胞逐漸表現(xiàn)為均一的長梭形。SFM接種的EnMSCs與SCM接種的EnMSCs相比，形態(tài)相似，但是前者呈明顯的漩渦狀生長，立體感更強。見圖1。

2 EnMSCs間充質(zhì)干細(xì)胞免疫表型流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD90、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC、CD13、CD29、CD44均呈陽性表達(dá)，CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達(dá)。見圖2。

3 EnMSCs細(xì)胞活率EnMSCs細(xì)胞活率流式 細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，SFM體系培養(yǎng)的EnMSCs成活細(xì)胞數(shù)目為94.27%±2.43% (n=5)，SCM體系培養(yǎng)的EnMSCs成活細(xì)胞數(shù)目為92.65%±2.92% (n=5)。SFM體系培養(yǎng)的EnMSCs細(xì)胞活率較高(P＜0.05)。見圖3。

4 EnMSCs細(xì)胞增殖和倍增時間 細(xì)胞貼壁后開始生長，1 ～ 2 d生長比較慢，于3 ～5 d進(jìn)入對數(shù)期，6 ～ 8 d進(jìn)入平臺期，根據(jù)吸光度值繪制的生長曲線呈“S”形，有明顯的滯留期，對數(shù)生長期及平臺期。SFM與SCM體系比較，1 ～ 2 d吸光度值無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，3 ～ 8 d SFM的吸光度值明顯優(yōu)于SCM(P＜0.05)，表明經(jīng)SFM培養(yǎng)的EnMSCs增殖能力更強，細(xì)胞生長狀況更好。見圖4。

5 EnMSCs成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化1)成脂分化兩種培養(yǎng)基擴(kuò)增的EnMSCs成脂誘導(dǎo)分化21 d并經(jīng)油紅O染色后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞質(zhì)中充滿紅色的油滴，提示細(xì)胞已經(jīng)分化呈脂肪細(xì)胞。2)成骨分化EnMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化21 d后，運用茜素紅進(jìn)行鈣化結(jié)節(jié)染色，可見致密生長的細(xì)胞中散在出現(xiàn)大小不一的橘紅色礦化結(jié)節(jié)。染色結(jié)果顯示兩種培養(yǎng)基擴(kuò)增的EnMSCs均有成骨分化能力。3)成軟骨分化EnMSCs經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)分化21 d后，阿利辛藍(lán)染色可見細(xì)胞呈亮綠色，提示兩種培養(yǎng)體系培養(yǎng)出的細(xì)胞均能有成軟骨分化能力。見圖5。

圖 1 無血清培養(yǎng)條件下子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(左)；有血清條件下子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞(右)(×100)Fig. 1 EnMSCs in SFM (left) and in SCM (right)(×100 magnification)

圖 2 無血清和有血清子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)對比Fig. 2 Expression of cell surface markers of EnMSCs cultivated in SCM and SFM

圖 3 有血清培養(yǎng)條件下子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞活率的柱狀圖(左)，有血清條件下子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的柱狀圖(右)Fig. 3 Histogram of cell viability in cultured EnMSCs in SFM detected by flow cytometry (left), histogram of cell viability in cultured EnMSCs in SCM detected by flow cytometry (right)

圖 4 無血清和有血清條件下子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長曲線Fig. 4 Growth curve of EnMSCs in SFM and SCM

討 論

EnMSCs是一個極具吸引力的干細(xì)胞再生治療來源，其主要優(yōu)勢是非侵入性獲得，是一種穩(wěn)定的自體干細(xì)胞來源，且其易于擴(kuò)展。迄今為止，EnMSCs已經(jīng)應(yīng)用于多種臨床試驗以及一些小動物的研究，將EnMSCs移植到肌營養(yǎng)不良小鼠的骨骼肌中，可以觀察到其對肌肉有一定的修復(fù)作用[12]；EnMSCs具有分化成平滑肌細(xì)胞的能力，已被嘗試應(yīng)用于膀胱壁的重建[13]。也有研究將EnMSCs和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分別移植到心肌梗死鼠模型的心臟內(nèi)，可以觀察到移植EnMSCs鼠的心臟梗死面積更小[14]。

圖 5 無血清培養(yǎng)基成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化(左)，右圖為無血清培養(yǎng)基成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化(右)(×100)Fig. 5 Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiations of EnMSCs in SFM (left); Adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiations of EnMSCs in SCM (right)

目前，對于EnMSCs培養(yǎng)主要用合成細(xì)胞培養(yǎng)基，一般會在培養(yǎng)基中加入5% ～10%的胎牛血清[15-16]，這對培養(yǎng)產(chǎn)物的分離、純化和檢測會帶來一定的不便，在細(xì)胞的使用上也會帶來病毒和免疫的隱患。并且血清的成分是未知的，變化是莫測的，已被報道可能影響再生能力[17]。而無血清培養(yǎng)基組分穩(wěn)定，性能一致性高，培養(yǎng)細(xì)胞科研評估精確，對培養(yǎng)細(xì)胞影響小，不含有絲分裂原抑制劑及其他生長抑制物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖；降低病毒、真菌、支原體等微生物污染的可能性等。然而，我國無血清培養(yǎng)的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于國外，無血清培養(yǎng)基的來源主要依賴于國外產(chǎn)品，成本較高，應(yīng)用也較少，至今未見關(guān)于應(yīng)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞的報道。EnMSCs應(yīng)用于人體的安全性備受關(guān)注。如何安全有效地擴(kuò)展EnMSCs成為了亟需解決的問題。為了使子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞從基礎(chǔ)研究走向臨床應(yīng)用，必須應(yīng)用無血清培養(yǎng)體系。

本研究中，SFM培養(yǎng)的EnMSCs克隆團(tuán)細(xì)胞排列緊密，形似鳥巢，呈明顯漩渦狀，表明所培養(yǎng)的細(xì)胞具有形成克隆的能力，符合EnMSCs的形態(tài)特征。從SFM和SCM培養(yǎng)條件下增殖能力可以看出，SFM培養(yǎng)條件下的EnMSCs在細(xì)胞適應(yīng)期增殖能力稍差于SCM體系培養(yǎng)的EnMSCs，但是在細(xì)胞適應(yīng)后，SFM體系培養(yǎng)的EnMSCs表現(xiàn)出更強的增殖能力。據(jù)一些文獻(xiàn)報道，低密度的干細(xì)胞在SFM體系擴(kuò)增困難，但是當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到一定密度，由于干細(xì)胞自身能夠分泌多種生長因子，可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，EnMSCs能夠快速擴(kuò)增，且擴(kuò)增能力優(yōu)于SCM。免疫表型是鑒定MSCs的一種重要的方法，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，CD90、CD73、CD105、CD166、HLA-ABC、CD13、CD29、CD44均呈陽性表達(dá)，CD34、CD45、CD14、HLA-DR、CD19呈陰性表達(dá)，證明此細(xì)胞非造血干細(xì)胞來源，均與文獻(xiàn)描述一致[17]。經(jīng)細(xì)胞活率鑒定，SFM體系培養(yǎng)的EnMSCs細(xì)胞活率更高，表明經(jīng)SFM培養(yǎng)的干細(xì)胞更適用于干細(xì)胞的治療，穩(wěn)定性更強。經(jīng)成脂、成骨、成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，SFM培養(yǎng)的EnMSCs具有良好的成脂、成骨誘導(dǎo)分化能力，上述特征符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)[14]。

綜上所述，本實驗證明無血清培養(yǎng)基可以培養(yǎng)出子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞，且分化能力并未受到影響，無血清培養(yǎng)基子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞代替?zhèn)鹘y(tǒng)的動物血清培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞是可行的。

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Feasibility of serum-free medium in cultivating endometrium-derived mesenchymal stem cell

KANG Kang1,2, WANG Aiming1,2, YIN Shande2, ZHAO Yong2, WANG Mingkai2, HUANG Shaomin1
1Chinese PLA Medical School, Beijing 100853, China;2Department of Obstetrics & Gynecology, Navy General Hospital, Beijing 100048, China.

WANG Aiming. Email: one_army@sina.com

ObjectiveTo dissect and amplify the endometrium-derived mesenchymal stem cells (EnMSCs) in serum-free medium (SFM) in vitro and assess their bionomics.MethodsBionomics of EnMSCs in SFM and serum-containing (fetal bovine serum) medium (SCM), such as morphology, phenotype, proliferative activity, cell viability and differentiation capability, were compared.ResultsSimilar cell morphology was shown within EnMSCs cultivated both in SFM and SCM, while the EnMSCs cultured in SFM showed obvious swirling growth and stronger three-dimensional effect, which was more slender. Surface markers of EnMSCs cultivated both in SFM and SCM were all positive. Cell viability and cell proliferation were higher in SFM than in SCM.ConclusionAccording to the results of the present study, we can conclude that EnMSCs can be cultivated in SFM with no changes in their differentiating capacity in vitro, and their bionomics (proliferation and cell viability) are better performed than those cultivated in SCM. Therefore, SFM can be used in cell therapy instead of fetal bovine serum. This finding gives us a hope for future cell therapy studies and trials with little concern about zoonotic infections or immunological reaction.

endometrium-derived mesenchymal stem cell; cell proliferation; cell cycle; differentiation

R 394.26

A

2095-5227(2015)06-0563-05

10.3969/j.issn.2095-5227.2015.06.011

時間：2015-03-13 15:42

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20150313.1542.003.html

2014-10-21

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2012BAI32B05)；國家自然科學(xué)基金項目(81000245；81370703)；全軍后勤科研課題(CHJ 13J012)

Supported by the National Key Technology R&D Program of the Ministry of Science and Technology of People's Republic of China(2012BAI32B05); National Natural Science Foundation of China(81000245; 81370703); Scientific research Program of General Logistics Department of PLA(CHJ 13J012)

康康，女，在讀碩士，醫(yī)師。研究方向：生殖內(nèi)分泌與輔助生殖。Email: kangtingting1988@126.com

王藹明，女，博士，主任醫(yī)師。Email: one_army@sina. com