RP-HPLC法同時(shí)測定成人血清中苦參素和阿德福韋酯的濃度方法學(xué)研究

陳 紜，黃曉暉，吳婷妮，魏麗華，楊海婷，劉真真，李 冬，李琳琳，潘 亭

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國現(xiàn)有乙型肝炎病毒攜帶者約1．2億，有3 000多萬慢性乙型肝炎患者［1]，因此，慢性乙型肝炎的預(yù)防、診斷和治療是乙型肝炎防治的重要課題和研究熱點(diǎn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療乙型肝炎是減少和降低肝硬化和肝癌發(fā)生的關(guān)鍵［2]。苦參素是從豆科植物苦豆子及苦參中提取分離的生物堿。臨床研究表明，苦參素有抗癌、抗病毒、抗炎、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗心律失常等作用，主要用于治療慢性乙型肝炎及放、化療引起的白細(xì)胞減少等［3]，且相對于苦參堿，苦參素毒性更低［4]。阿德福韋酯是新型核苷類抗乙型肝炎病毒藥物，國外臨床研究資料表明，阿德福韋酯能有效地抑制HBV DNA的復(fù)制，使HBV DNA滴度迅速降低，阿德福韋酯雖起效慢，但耐藥率低、持續(xù)應(yīng)答率高，阿德福韋酯不僅是抗HBV的首選藥物，也常用于拉米夫定耐藥的挽救治療［5]。研究表明，阿德福韋酯聯(lián)合苦參素治療慢性乙型肝炎療效較單用阿德福韋酯療效顯著［6]。苦參素和阿德福韋酯臨床聯(lián)用治療乙肝患者，可以提高阿德福韋酯抗病毒療效，能夠有效抑制HBV DNA的復(fù)制，控制療效顯著［7]。對于乙肝的患者，我們應(yīng)該定期監(jiān)測聯(lián)用這兩種藥的血藥濃度，確保其用藥安全性。本文首次采用RP-HPLC法，建立聯(lián)合治療乙肝患者血清中苦參素和阿德福韋酯血藥濃度檢測方法，便于這兩種藥物的臨床血藥濃度監(jiān)測，國內(nèi)外無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(包括LC-20ATvp溶劑輸送泵，Rheodyne 7725i手動進(jìn)樣閥，SPD-M 20A紫外—可見檢測器，LC-Solution色譜數(shù)據(jù)工作站等);Neofuge23R臺式高速冷凍離心機(jī)(力康發(fā)展有限公司);超純水機(jī)(美國Millipore ROIS5 30L TANK);DL-360A超聲波脫氣機(jī);電子天平(型號:BLXKJA3003B)等。苦參素對照品(溫州市華基化工有限公司，批號:201301);阿德福韋酯對照品(北京奇松生物科技有限公司，批號:201302);甲醇為HPLC專用色譜純，水為二次蒸餾水;標(biāo)準(zhǔn)空白人血清由中國食品藥品檢定研究院提供。

2 方法

2．1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流動相:甲醇—水(70∶30);流速:1．1 mL·min－1，檢測波長:229 nm，柱溫:40℃。

2．2 對照溶液的配制 精密稱定苦參素和阿德福韋酯標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，用甲醇配制苦參素100 mg·L－1阿德福韋酯 100 mg·L－1的對照品貯備液;分別取適量貯備液，用甲醇精密稀釋成2 mg·L－1的苦參素和1 mg·L－1阿德福韋酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液，放在冰箱冷藏貯存待用。

2．3 血樣處理 取標(biāo)準(zhǔn)空白人血清100μL，加入2 mg·L－1苦參素標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 和1 mg·L－1阿德福韋酯的樣品標(biāo)準(zhǔn)液各100μL，加100μL甲醇，漩渦混勻，8 000 r·min－1，4℃離心 10 min，取 20 μL進(jìn)樣。

2．4 方法專屬性考察 分別取空白血清、標(biāo)準(zhǔn)品溶液、樣品血清20μL進(jìn)樣，色譜圖(圖1)中苦參素保留時(shí)間為4．6 min左右，阿德福韋酯的保留時(shí)間為7．3 min左右，兩藥能完全分離且無雜質(zhì)峰干擾。

2．5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取空白試管，先加入血清1 mL，再分別加入一定量的苦參素和阿德福韋酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液，配成苦參素濃度為 0．012 5、0．025、0．05、0．1、0．5、1、2 mg· L－1及阿德福韋酯濃度為0．012 5、0．025、0．062 5、0．125、0．25、0．5、0．75 mg·L－1的系列混合血樣，按上述2．3項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，各進(jìn)樣20μL，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度(X)為橫坐標(biāo)，得苦參素和阿德福韋酯的回歸方程，苦參素為 Y=4．2 ×105X+54 906(r2=0．999 2)，阿德福韋酯為 Y=1．8 ×105X+2 528．4(r2=0．999 1)。結(jié)果表明苦參素和阿德福韋酯血藥濃度分別在0．012 5 ～2 mg·L－1、0．012 5 ～0．75 mg·L－1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另取標(biāo)準(zhǔn)品溶液經(jīng)水稀釋后按信噪比大于3的要求試驗(yàn)，結(jié)果苦參素和阿德福韋酯的最低檢測限分別為0．003 mg·L－1和0．002 mg·L－1(圖2)。

2．6 回收率試驗(yàn) 分別準(zhǔn)確稱取苦參素和阿德福韋酯標(biāo)準(zhǔn)品適量，置于100 mL容量瓶中，配制成含苦參素低、中、高 3 種濃度為 0．025、0．1、1 mg·L－1和阿德福韋酯低、中、高 3種濃度為 0．025、0．125、0．5 mg·L－1的模擬樣品溶液9份，每個(gè)濃度各3份，加入到1 mL血清中。

均按2．3項(xiàng)下方法進(jìn)行操作后進(jìn)樣，各取20μL進(jìn)樣，并計(jì)算回收率(結(jié)果見表1)。由表1可見，低、中、高濃度苦參素回收率均在92%以上，該法的提取回收率良好。

2．7 精密度 取空白試管分別加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入1 mL血清，使苦參素血清藥物濃度分別為0．025、0．1、1 mg·L－1，使阿德福韋酯血清藥物濃度分別為 0．025、0．125、0．5 mg·L－1。按2．3項(xiàng)下方法操作，計(jì)算日內(nèi)變異和3 d內(nèi)日間變異(見表2)。

表1 血清中苦參素和阿德福韋酯回收率的測定結(jié)果(n=5)

表2 苦參素和阿德福韋酯精密度結(jié)果(n=5)

2．8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在空白血清中分別加入適量的苦參素和阿德福韋酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，配置成苦參素和阿德福韋酯的濃度分別為0．100 mg·L－1的血漿樣品，分別于 0、2、4、6、12、24 h 時(shí)各取 1 mL，然后按 2．3項(xiàng)下方法操作，各取20μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果苦參素和阿德福韋酯的RSD分別為5．8%、3．6%，表明苦參素和阿德福韋酯的血漿樣品至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3 討論

3．1 檢測波長的選擇 在波長選取時(shí)，苦參素和阿德福韋酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在210～380 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦參素在229 nm波長處有最大吸收，阿德福韋酯在260 nm波長處有較大吸收，考慮229 nm阿德福韋酯吸收也較好，選擇229 nm作為此次試驗(yàn)檢測波長。

3．2 流動相的優(yōu)化選擇 參考文獻(xiàn)［8]，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定甲醇∶水(70∶30)為流動相優(yōu)于其它流動相系統(tǒng)，苦參素與阿德福韋酯在此系統(tǒng)能夠很好分離，且不受其他峰干擾，并且二者的保留時(shí)間均小于10 min，可以同時(shí)測定人血清中苦參素與阿德福韋酯濃度。

3．3 血樣提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)血清樣品的前處理方法采用了甲醇蛋白沉淀法提取，乙醚和二氯甲烷的液液萃取法，綜合比較回收率，成本等因素，最終采用甲醇蛋白沉淀法，該方法藥物的回收率較高，減少了樣品處理的所需時(shí)間和工作量，而且降低了樣品處理的成本。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明該法線性關(guān)系好，回收率高，操作簡單快速，在國內(nèi)為同時(shí)監(jiān)測人血清中苦參素和阿德福韋酯的濃度提供了簡便可行的方法，還可以用于藥物代謝動力學(xué)研究。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜—紫外檢測法(HPLC-UV)測定健康成人血漿樣品中苦參素和阿德福韋酯的藥物濃度，并探索和改進(jìn)方法，從而為同時(shí)監(jiān)測聯(lián)合用藥下人體藥物代謝動力學(xué)研究進(jìn)一步提供方法學(xué)參考。實(shí)際樣本測定的相關(guān)研究將在我院繼續(xù)進(jìn)行。

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