保護性自噬對順鉑誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡的抑制作用探討

楊 翠，王 猛，武 超，夏 泉，許杜娟，

(1．安徽醫科大學藥學院，安徽合肥 230032;2．安徽省立醫院，安徽合肥 230001 3．安徽醫科大學第一附屬醫院，安徽合肥 230022)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，化療是乳腺癌治療的一項重要措施，術后化療可以消滅人體內可能已存在的微小轉移灶或微小殘余病灶，延長病人無病生存期及總生存。有相關的文獻報道化療藥物順鉑聯合17-Demethoxy-reblastain或吉西他濱治療三陰性乳腺癌［1－2]，紫杉醇聯合順鉑能有效地抑制人乳腺癌MCF-7的增殖［3]，許多化療藥物是通過誘導腫瘤細胞凋亡而實現對腫瘤細胞的殺傷作用。自噬是一種細胞內溶酶體依賴性代謝過程，通過更新和消除缺損的或多余的蛋白質和受損或老化的細胞器來維持細胞穩態［4]。在哺乳動物細胞中，自噬大致分為三種:(1)巨自噬是主要的自噬形式;(2)微自噬是溶酶體的膜直接包裹胞質中的成分，形成一個內在的囊泡并在溶酶體降解;(3)分子伴侶介導的自噬(CMA)是胞漿中的蛋白質與分子伴侶結合后被轉運到溶酶體腔，從而被溶酶體消化的過程。自噬是一個動態過程，可人為的將它分為四個階段［5]:(1)誘導和起始，而在這一過程受哺乳動物雷帕霉素(mTOR)靶點的負調控;(2)成核，受Beclin1和hVps34/classⅢ PtdIns3K復合體調控;(3)自噬體的形成，隨著隔離膜邊緣的融合，被包裹的胞質成分完全被隔離開形成自噬體;(4)成熟和降解，自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體并降解所包裹的成分，降解產物在細胞內再循環利用。近年來的研究顯示，自噬在腫瘤的治療中有不可忽視的作用，而且自噬與凋亡的關系十分密切［6]。最近研究顯示，順鉑能誘導人癌細胞如肝癌、宮頸癌、皮膚癌等自噬，并且這種自噬對腫瘤細胞是一種保護性機制，降低腫瘤對化療藥物順鉑的敏感性［7－9]。但是，順鉑是否能誘導人乳腺癌MCF-7細胞發生自噬尚無報道。本研究觀察了順鉑處理乳腺癌MCF-7細胞后自噬的發生，并初步探討了自噬在順鉑誘導凋亡中的作用。

1 材料與方法

1．1 細胞株和主要試劑 人乳腺癌細胞株MCF-7(安徽醫科大學基礎醫學院沈玉先教授惠贈);DMEM高糖培養液(Hyclone生物技術有限公司);新生小牛血清(杭州四季青);甲基偶氮唑藍(MTT);吖啶橙(AO)，氯喹(Chloroquine)，Hoechst 33342，順鉑購自于sigma公司，p62/SQSTM1抗體購自MBL公司，LC3和PARP抗體購自cell signaling公司。

1．2 方法

1．2．1 細胞培養 人乳腺癌MCF-7為貼壁的細胞株，采用含10%熱滅活的新生小牛血清(FCS)的高糖培養基DMEM培養液，并加入青霉素100 IU·mL－1和鏈霉素 100 mg·L－1的培養體系于 37℃，5%的CO2培養箱中培養，取對數生長期的細胞進行實驗。

1．2．2 MTT檢測細胞活力 取對數生長期MCF-7細胞，0．25%胰酶消化后用DMEM培養基制成單細胞懸液，以每毫升5×104個細胞密度接種于96孔培養板中，每孔100μL。培養24 h后分別加入既定濃度的順鉑，每組設5個復孔，每孔終體積200μL。分別培養24 h和48 h后，加入5 g·L－1的MTT每孔20μL，繼續培養4 h后棄去上清，加入二甲基亞砜(DMSO)每孔150μL，微振蕩器上震蕩10 min，酶標儀測490 nm波長處的吸光度值，取各組均值，重復實驗3次。

1．2．3 細胞凋亡檢測 細胞以每孔3×105個種在6孔板中，分為對照組、順鉑組、氯喹組、順鉑+氯喹組，處理24 h后，棄去培養基，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌1次，固定在4%的低聚甲醛15 min，然后用PBS溶解的2 mg·L－1Hoechst 33342每孔加入1 mL，PBS洗2次(10 min)，熒光顯微鏡觀察核染色。

1．2．4 吖啶橙(AO)分析酸性自噬囊泡 細胞以每孔2×105個接種到6孔板中，培養24 h貼壁，用不同濃度的順鉑處理24 h后，PBS洗滌2次，用吖啶橙染色(最終濃度為2 mg·L－1)室溫避光15 min，然后用PBS洗滌2次，熒光顯微鏡觀察酸性囊泡自噬體。

1．2．5 Western blot檢測 p62、LC3Ⅰ/Ⅱ、PRAP 蛋白表達 收集對照組和處理組MCF-7細胞，4℃預冷的PBS洗滌3次，加入適量的含有蛋白酶抑制劑100 mmol·L－1的PMSF的RIPA(1%聚乙二醇辛基苯基醚，1%脫氧膽酸，0．1%十二烷基硫酸鈉)裂解液中于冰上裂解 30 min，4℃，12 000 r·min－1離心30 min，取上清，與5×蛋白上樣緩沖液混合后煮沸10 min，將樣品在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進行電泳，然后轉印至硝酸纖維素膜(PVDF)上。用5%的脫脂牛奶封閉3 h后，加入既定的抗體，4℃過夜。Tris-HCL緩沖鹽溶液(TBST)洗滌4次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫作用1 h，ECL法顯色。

1．3 統計學分析 所有數據均為3次獨立實驗結果，均為計量資料，通過正態性檢驗，文中以(x±s)表示。采用SPSS 16．0統計軟件進行統計學分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組之間的比較采用t檢驗，P＜0．05表示差異有統計學意義。

2 結果

2．1 順鉑對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 順鉑對乳腺癌MCF-7的抑制作用如圖1A所示，順鉑從低濃度至高濃度(0，2，4，8，16，32 mg·L－1)分別作用于乳腺癌MCF-7細胞24 h和48 h后，均能劑量和時間依賴地降低細胞的存活率，同時Hoechst 33342染色分析不同濃度的順鉑(0、4、8、16 mg·L－1)作用于MCF-7細胞結果顯示，順鉑呈劑量依賴性的誘導細胞的凋亡。如圖1B所示。

2．2 順鉑誘導乳腺癌MCF-7細胞自噬的發生

吖啶橙染色(acridine orange staining)觀察用不同濃度的順鉑處理MCF-7細胞24 h后，自噬關鍵的形態學特征酸性自噬溶酶體的形成，如圖2A所示8 mg·L－1順鉑能明顯誘導酸性自噬溶酶體的形成;Western blot結果顯示自噬標記蛋白LC3Ⅱ和p62水平分別呈劑量依賴性增加和減少，并且8 mg·L－1順鉑能夠明顯誘導LC3Ⅱ表達的增加及p62表達的減少(圖2B)。同時，順鉑聯合自噬抑制劑氯喹能夠明顯增加LC3Ⅱ的表達及抑制p62的降解(圖2C)。以上結果表明順鉑誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡的同時，也誘導了自噬的發生。

2．3 順鉑誘導乳腺癌MCF-7保護性自噬抑制了凋亡的發生 8 mg·L－1的順鉑和5μmol·L－1的氯喹(chloroquine，CQ)聯合作用MCF-7細胞24 h，聯合組與單藥順鉑組相比，細胞存活率明顯降低［(89．17%±2．56%)vs(74．63% ±1．51%)，P ＜0．05，圖 3A]，Western blot結果顯示，順鉑和氯喹聯合凋亡蛋白PRAP出現明顯的裂解(圖3B)。我們的結果證實，抑制自噬增強了順鉑誘導的乳腺癌MCF-7細胞凋亡。

3 討論

自噬是細胞通過雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運送到溶酶體形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內容物，以實現細胞本身的代謝需要和細胞器的更新［10]。細胞在化療、饑餓、缺氧等應激的條件下能激活細胞自噬的發生，并且自噬和凋亡密切相關。近年來研究顯示，某些化療藥物如柔紅霉素不僅能誘導腫瘤細胞的凋亡，而且激活了自噬［11]，以往的研究表明順鉑能誘導乳腺癌細胞的凋亡，但是順鉑能否誘導乳腺癌MCF-7細胞自噬的發生尚無報道。我們的研究結果顯示，隨著順鉑濃度的提高，對MCF-7細胞增殖抑制和誘導凋亡作用明顯增強，同時自噬相關蛋白LC3Ⅱ明顯增加和p62水平明顯減少，LC3和p62的特殊變化提示自噬被激活。自噬在腫瘤細胞中的作用是一把雙刃劍，一方面，自噬的發生可抑制腫瘤細胞的生長［12];另一方面自噬的發生可促進腫瘤細胞的存活［13]，最終導致腫瘤細胞對化療藥物抵抗。Shimizu等［14]研究顯示索拉菲尼誘導肝癌保護性自噬，用藥理學自噬抑制劑能增強索拉菲尼的抗腫瘤活性，Shen等［15]研究表明血管內皮生長因子受(VEGFR)，表皮生長因子受體(EGFR)，和RET酪氨酸激酶小分子抑制劑ZD6474能提高膠質母細胞瘤自噬水平，抑制自噬能增加ZD6474的促凋亡作用。我們的結果顯示，與順鉑相比，自噬抑制劑氯喹聯合順鉑處理MCF-7細胞后，細胞的存活率明顯下降，誘導凋亡作用明顯增強。這說明，順鉑誘導MCF-7細胞保護性自噬，它部分抑制了順鉑誘導的乳腺癌細胞凋亡。

總之，順鉑誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡，同時也誘導了保護性自噬的發生。抑制自噬能增加乳腺癌對順鉑的敏感性，順鉑聯合自噬抑制劑很可能成為治療乳腺癌的新策略，為今后乳腺癌的臨床治療提供重要的理論依據。

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