環介導等溫擴增法與臨床常規方法檢測淋球菌效果比較

鄧鵬程，鄺滿元，王岐本，張如勝

（1.湘南學院基礎醫學部解剖教研室，湖南郴州423000；2.長沙市疾病預防控制中心，湖南410001）

環介導等溫擴增法與臨床常規方法檢測淋球菌效果比較

鄧鵬程1，鄺滿元1，王岐本1，張如勝2

（1.湘南學院基礎醫學部解剖教研室，湖南郴州423000；2.長沙市疾病預防控制中心，湖南410001）

目的將環介導等溫擴增（LAMP）法與涂片及細菌培養法2種臨床常規檢測淋球菌的方法進行比較研究，探討LAMP法用于快速診斷淋球菌感染的可行性。方法同時采用LAMP法與涂片及細菌培養2種方法，對2011年10月至2013年8月長沙市疾病預防控制中心性病門診疑似淋菌感染患者86例的生殖道分泌物進行檢測，并對3種檢測方法分別獲得的陽性結果進行分析。結果運用LAMP法檢測得到淋球菌陽性率[91%（78/86）]高于涂片法[60%（52/ 86）]和細菌培養法[53%（46/86）]，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論使用LAMP法檢測淋球菌具有快速、簡便、直觀、特異、敏感及不需要特殊儀器等優點，有望成為一種新型實用的淋球菌核酸檢測手段。

奈瑟球菌，淋病； 基因擴增； 培養技術； 涂片

淋病是淋病奈瑟菌（簡稱淋球菌）引起的以泌尿生殖系統化膿性感染為主要表現的性傳播疾病，其發病率高居我國性傳播疾病第2位。比較不同的淋球菌檢測方法并研發快速、高效的診斷方法，對于患者能進行及時有效的治療和避免其在人群中快速傳播均意義重大。針對淋球菌的檢測，臨床常規檢測采用的是涂片法和細菌培養法。2010年國內學者崔亞利等[1]以淋球菌標準菌株基因組DNA為模板，進行環介導等溫擴增（LAMP）法擴增，成功建立了檢測淋球菌基因的LAMP法，為淋球菌的快速檢測提供了新的手段。為了比較用LAMP法和臨床常規方法檢測淋球菌的效果，本研究組同時運用這3種技術對86例疑似淋菌感染患者的泌尿生殖道分泌物進行檢測，檢測過程及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 本組研究對象為2011年10月至2013年8月在長沙市疾病預防控制中心性病門診就診的86例泌尿生殖系統感染患者。入選標準：曾有不潔性生活史且尿道口或生殖道有明顯的膿性分泌物，經主治醫師以上級別的醫生診斷疑為淋病患者，其中男56例，女30例；年齡18～58歲。

1.1.2 標本采集

1.1.2.1 女性患者 月經干凈后10～14 d，將采樣無菌棉拭子（常規檢查一般用生理鹽水浸濕的棉拭子取材）置于陰道深部或陰道后穹隆轉動并停留10～30 s取分泌物。

1.1.2.2 男性患者 將采樣無菌棉拭子深入到距離男性患者尿道口2～3 cm處，輕輕轉運并停留10～15 s取出帶有黏膜細胞的膿性分泌物。

1.2 方法

1.2.1 涂片法 將淋病患者的泌尿生殖道分泌物標本涂片經革蘭染色后，在顯微鏡下觀察多核白細胞，其內有革蘭陰性雙球菌出現診斷為陽性。

1.2.2 細菌培養法 標本采集后立即分區接種于經室溫（25℃）平衡的選擇性培養基中，接種后的平皿置于35～36℃、5%CO2和濕度大于70%的培養箱內進行24～28 h菌株培養，再通過半自動細菌鑒定儀對標本進行鑒定。

1.2.3 LAMP法 LAMP檢測采用深圳博睿祥輝生物技術有限公司生產的通用型LAMP反應液試劑盒，標本DNA提取和LAMP擴增均按試劑盒說明書進行，主要操作步驟為：反應模板DNA提取，將棉拭子采集的標本置于1mL生理鹽水的無菌離心管中浸泡10min，管內壁擠干丟棄，離心10min，棄上清液，加入終質量濃度0.1 g/L蛋白酶K和終濃度1%十二烷基磺酸鈉（SDS），55℃水浴60min，酚氯仿法提取目標基因。引物設計，利用Primer-ExplorerV3軟件設計淋球菌16S rRNA基因的引物，16S rRNA是16S核糖體rRNA基因，其特點是穩定，在細胞內含量較高，具有特異性和敏感性。16S rRNA：F3 GCGGTGGATGATGTGGATT，B3 CCGGCAGTCTCATTAGAGTG，FIP CTCCTCCGTCTCCGGAGGATTCGATGCAACGCGAAGAACCT，BIP TCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAT-CCCAACCGAATGATGGCA，LF CGCACATGTCAAAACCAGGTA，LB GTTGGGTTAAGTCCCGCAACG。LAMP擴增反應體系建立：引物BIP和FIP各2μL，F3及B3各0.2μL，LF和LB各1μL，10mmol/L的dNTPs 4μL，5mol/L的betaine4μL，160mmol/L的MgSO41μL，10×BstDNA Polymerase Buffer2.5μL，BstDNA Polymerase8 U，DNA模板 2μL，加雙蒸水（ddH2O）至反應液為25μL，置于恒溫（65℃）水浴箱經60min完成擴增反應，后將其迅速置于80℃水浴箱反應2min終止反應。加SYBRGreen 1μL，肉眼觀察顏色變化，擴增產物檢測管變綠為淋球菌陽性，擴增產物檢測管呈現棕色則為淋球菌陰性。取擴增產物1.5μL經3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增產物有無梯狀條帶出現判斷結果，檢測管擴增產物經電泳后呈梯狀條帶為淋球菌陽性，而檢測管擴增產物經電泳后未出現梯狀條帶為淋球菌陰性。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

LAMP技術檢測的淋球菌陽性率明顯高于涂片及細菌培養法，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 3種淋球菌檢測方法結果

3 討 論

淋病是由淋球菌所引起的一種泌尿生殖道黏膜傳染性疾病，淋病的病原菌為淋球菌，是一種革蘭陰性雙球菌，呈卵圓或腎形，成對排列。淋病潛伏期為2～10 d，在臨床上有5%～2%的男性和60%的女性感染后可無明顯癥狀，如不及時診斷與治療，常誘發不孕不育癥、性功能障礙及其他各種并發癥。淋病通過性接觸直接傳染，也可通過患者分泌物污染物及醫療器械間接傳染，特別是幼女常通過間接途徑感染，新生兒可通過患淋病母親的產道感染，引起淋菌性結膜炎，如延誤治療，可能導致失明。淋病在人群中的快速傳播極其嚴重的危害不容忽視，開發快速準確的淋球菌檢測方法意義重大。

目前臨床上較常用的淋球菌檢測法是涂片和細菌培養法，男性急性淋病直接涂片檢測到多形核白細胞內革蘭陰性雙球菌即可成立診斷，不足之處是對慢性患者靈敏度較低，而女性陰道分泌物中雜菌多，大大降低了敏感性和特異性，陽性率不高且有假陽性。培養出淋球菌是診斷淋病的重要佐證，細菌培養法對癥狀很輕或無癥狀的男性及女性患者都是較好的方法，只要培養陽性就可確診，但培養法耗時且很受患者用藥影響。細菌培養法是世界衛生組織推薦淋球菌的標準檢測方法，但在臨床工作中，用細菌培養法檢測淋球菌受到操作技術、菌株存活環境、檢測時間、試劑質量以及患者在檢測前是否使用過抗生素等因素的限制[2]。

20世紀90年代以來，隨著分子生物學技術的發展，PCR檢測技術逐漸被運用于淋球菌的實驗室檢驗中，根據淋球菌的特異基因序列設計引物，對淋球菌進行PCR檢測逐漸成為傳統的涂片和淋菌培養法的協助診斷方法。PCR法具有靈敏度高，特異性強，不斷應用于臨床標本的檢測，但針對淋球菌性淋病的PCR仍有一些限制，比如，費用昂貴、污染的風險、不能提供抗生素抵抗的信息等。此外，還有序列相關性限制，尤其是假陽性結果是一個主要需要考慮的問題[3]。因此，需要新的檢測技術，LAMP法是2000年Notomi等[4]報道的一種新型核酸擴增技術，其針對靶序列上的特異區域設計引物，用具有鏈置換活性的DNA聚合酶快速擴增目的基因片段，形成大量具有大小不等莖環結構的基因片段。其特異性強，快速高效擴增，在30～60min內擴增出109～1010倍的目的基因，擴增速度比傳統PCR高出2～3個數量級，LAMP反應還產生大量白色的焦磷酸鎂沉淀，肉眼觀察即可見沉淀，加SYBRGreen 1μL后反應管顏色明顯變化，擴增產物檢測管變綠為陽性，擴增產物檢測管呈現棕色則為陰性。取擴增產物1.5μL經2%～3%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增產物有無梯狀條帶出現即可判斷結果，檢測管擴增產物經電泳后呈梯狀條帶則為陽性，檢測管擴增產物經電泳后未出現梯狀條帶則為陰性，結果易于鑒定，LAMP擴增反應在恒溫下即可進行，只需一臺恒溫箱，不要需昂貴的設備，操作簡單方便而耗時少[5]。近年來，國內外許多科研工作者[6-8]，應用LAMP技術成功對炭疽芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、結核分枝桿菌等細菌類病原微生物進行檢測，而且通過對眾多細菌研究結果表明，與傳統PCR相比，LAMP法不僅快速、敏感，而且具有良好的特異性[9]。

本研究采用LAMP法對淋球菌特有16S rRNA基因設計引物，進行快速擴增檢測淋球菌，通過對比3種檢測方法得出：運用LAMP法、涂片及細菌培養法檢測到的淋球菌陽性率分別為91%、60%和53%，用LAMP法檢測的淋球菌陽性率明顯高于涂片及細菌培養法。與PCR技術相比，新型的LAMP法無需昂貴、精密的PCR儀器設備，也不需要DNA的熱變性、長時間的溫度循環以及一級產物后續檢測等步驟，LAMP法更為快速，而且操作簡便，檢測成本更低。

在實驗個程中，本研究組對淋球菌檢出陽性患者進行追蹤回返，發現經過抗淋球菌治療后，患者疾病都有明顯好轉或痊愈，從而最大可能避免假陽性的出現。

綜上所述，LAMP法與臨床常用的涂片和細菌培養法相比，具有更高檢出率，可大幅度降低漏診且不受患者用藥影響，使用LAMP法檢測淋球菌具有快速（1 h）、簡便（只需要1臺普通恒溫水箱）、直觀（肉眼可以觀察結果）、特異、敏感及不需要特殊儀器等優點，為淋球菌的快速準確檢測提供了一種新的手段，有望成為臨床上淋球菌常規檢測的簡便方法，特別是對條件不理想的基層疾控和醫療機構淋病檢測的普及具有重要意義。

參考文獻

[1]崔亞利，何於娟，劉鑫，等.快速檢測淋球菌porA和16S rRNA基因的環介導等溫擴增技術的建立[J].中國生物制品學雜志，2010，23（10）：1125-1128.

[2]陳秀英.應用細菌培養法與PCR檢測法檢測淋病奈瑟氏菌的對比研究[J].求醫問藥，2012，10（5）：236-238.

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10.3969/j.issn.1009-5519.2015.07.037

：B

：1009-5519（2015）07-1057-03

2014-09-20

2014-11-10）

2010年湖南省高等學校科學研究項目（10C1240）。

鄧鵬程（1975-），男，湖南桂陽人，碩士研究生，講師，主要從事分子寄生蟲學、解剖教學與研究；E-mail：dpch333@163.com。