山羊源副流感病毒3型的分離與分子鑒定

李文良，毛 立，程素平，王秋生，黃加春，張紋紋，楊蕾蕾，江杰元*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.海安縣畜牧獸醫(yī)站，海安 226600；3.南通點石生物科技有限公司，南通 226000)

山羊源副流感病毒3型的分離與分子鑒定

李文良1，毛 立1，程素平2，王秋生2，黃加春3，張紋紋1，楊蕾蕾1，江杰元1*

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.海安縣畜牧獸醫(yī)站，海安 226600；3.南通點石生物科技有限公司，南通 226000)

2013年下半年至2014年3月，江蘇多地育肥羊出現(xiàn)呼吸道癥狀為主的疾病。采集不同發(fā)病場鼻拭子和血清樣品，檢測呼吸道相關(guān)病原，在大部分樣品中檢測到副流感病毒3型。將陽性病料接種于MDBK細胞，連續(xù)傳代5代，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗檢測證實分離到病毒，命名為JS2013。擴增完整的M基因，進行進化分析表明該毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有獨特的基因特征。這是國內(nèi)外首次報道山羊源副流感病毒3型的分離鑒定。

副流感病毒3型；山羊；呼吸道疾病；M基因；進化分析

副黏病毒是引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸道疾病的重要病原，副流感病毒3型(parainfluenza virus type 3，PIV3)是其中的重要成員[1]。PIV3屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，是有囊膜的單股負鏈RNA病毒。該屬病毒包括人副流感病毒1型和3型(HPIV1、HPIV3)、牛副流感病毒3型(BPIV3)和仙臺病毒[2]。PIV3宿主范圍很廣，已報道在牛、綿羊、山羊、豚鼠、野牛、水牛、犀牛、駱駝等動物存在PIV3感染[3]。BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，對世界養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的危害[4]。BPIV3引起的臨床表現(xiàn)差異較大，可以是無癥狀的亞臨床感染，也可以表現(xiàn)嚴重的呼吸道疾病。在應(yīng)激、營養(yǎng)缺乏、天氣突變等因素刺激下，BPIV3感染能造成組織損傷和免疫抑制，引起支氣管肺炎和繼發(fā)感染，造成較高的發(fā)病率和死亡率[3,5]。

中國已有牛群中分離到BPIV3的報道，證實國內(nèi)存在BPIV3a和BPIV3c兩個基因型[6-7]，但尚未有羊群中PIV3感染情況及其與BPIV3關(guān)系的報道。2013年下半年起江蘇多地山羊養(yǎng)殖場育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)等均不同以往。通過實際調(diào)查、多次采樣，對樣品中可能的相關(guān)病原進行檢測，在多數(shù)樣品中檢出PIV3，由細胞培養(yǎng)分離到病毒，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗證實，進一步對其M基因進行測序和進化分析，結(jié)果表明該毒株與BPIV3和HPIV3均具有顯著差異，在進化上處于獨立的分支。這將為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

Transzol UP試劑、一步法RT-PCR試劑盒、Taq酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自Axygen公司；pMD18-T載體購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 臨床表現(xiàn)與病料采集

2013年下半年起，江蘇南通等地山羊養(yǎng)殖場育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，發(fā)病率和死亡率較高，藥物治療效果較差。病羊表現(xiàn)為精神沉郁、流漿液或膿性鼻液、逐漸消瘦，部分羊腹瀉。剖檢病羊多數(shù)可見肺不同程度實變、腹腔積液、胰腫大出血、網(wǎng)膜和腸系膜米粒大小白色結(jié)節(jié)。采集不同地區(qū)9個羊場70份鼻拭子和血清樣品(表1)，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣品采集與PIV3 RT-PCR檢測結(jié)果統(tǒng)計

Table 1 Summary of the sampling，RT-PCR detection results

羊場編號FarmNo.地區(qū)Location采樣時間Collectiondate陽性數(shù)/總數(shù)No.positive/Total鼻拭子Nasalswabs血清SeraA江蘇海安2013-10-1101/5B江蘇海安2013-10-1106/15C江蘇海安2013-10-1101/5D江蘇海安2013-11-42/90E江蘇海安2013-11-44/50F江蘇海安2014-01-213/130G江蘇如東2014-01-131/21/1H江蘇南京2014-02-254/64/6I江蘇南京2014-03-191/21/1合計Total25/3714/33

1.3 病原檢測

取血清樣品和鼻拭子樣品200 μL，加入1 mL Transzol UP，按照說明書提取總RNA，最終溶于無RNase水中。RT-PCR擴增采用20 μL體系，其中2×reaction buffer Mix 10 μL，E-Mix 0.5 μL，MF1(AGTGATCTAGATGATGATCCA)/ MR1(GTTATTGATCCAATTGCTGT)各0.5 μL，RNA 4 μL，補水至20 μL。反應(yīng)程序：45 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

DNA采用常規(guī)酚氯仿抽提法提取。其他相關(guān)病原，羊呼吸道合胞病毒(ORSV)[8]、支原體[9-10]、小反芻獸疫病毒(PPRV)[11]、瘟病毒屬病毒[12]、口蹄疫病毒(FMDV)[13]、牛呼吸道冠狀病毒[14]均采用文獻報道的RT-PCR或PCR方法進行檢測。

1.4 病毒分離鑒定

取陽性血清和鼻拭子樣品，加入青鏈霉素，37 ℃孵育30 min，12 000 r·min-1離心20 min，取上清接種MDBK細胞，每天觀察細胞病變，培養(yǎng)5～7 d后收獲培養(yǎng)物，繼續(xù)傳代4次。提取每一代培養(yǎng)物的RNA，用引物MF1/MR1進行RT-PCR檢測并測序。

1.5 血凝試驗

通過血凝試驗測定不同代次病毒的血凝價。將分離病毒在96孔血凝板上進行2倍倍比稀釋，然后加入0.25%豚鼠紅細胞，37 ℃孵育45 min，以能使紅細胞完全凝集的最高稀釋度作為病毒的血凝價。

1.6M基因克隆與進化分析

根據(jù)GenBank不同毒株基因序列設(shè)計擴增完整M基因的兼并引物：MF2： AGCATCASMARCTCYRRAATMT；MR2：CTATTGYYTRATYTTYCCGACYCCT。反應(yīng)體系同上，反應(yīng)程序：45 ℃反轉(zhuǎn)錄40 min；94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。將RT-PCR產(chǎn)物純化后克隆到pMD18-T載體，經(jīng)PCR和酶切鑒定，陽性質(zhì)粒送南京斯普金生物科技有限公司進行測序。

用DNAStar、ClastalX1.83軟件分析測序結(jié)果，推導(dǎo)出氨基酸序列，并與GenBank上參考毒株的M基因序列進行比對，用MEGA 5.1軟件采用Neighbor-joining(NJ)方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析分離株與BPIV3和HPIV3的進化關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 病原檢測

使用BPIV3M基因特異引物MF1/MR1進行RT-PCR檢測，陽性樣品可見329 bp的目的條帶(圖略)。如表1所示，有25/37鼻拭子和14/33血清樣品為陽性，占全部樣品的55.7%；羊場陽性率為100%。在3/70(A場：2，C場：1)樣品檢出ORSV，在7/70(D場：3，E場：2 H場：2)樣品檢出綿羊肺炎支原體。PPRV、FMDV、牛冠狀病毒、瘟病毒均為陰性。

將M基因RT-PCR產(chǎn)物克隆后測序，BLAST結(jié)果表明其與BPIV3毒株BN-CE相似性最高，但僅為82%(表略)。進一步對不同樣品RT-PCR產(chǎn)物進行測序發(fā)現(xiàn)完全相同，提示其為同一毒株。

2.2 病毒分離鑒定

將病料處理后接種MDBK細胞，第2代出現(xiàn)細胞病變，細胞融合、脫落。取每一代細胞培養(yǎng)物，用引物MF1/MR1進行RT-PCR檢測，均能擴增出相應(yīng)大小目的片段。

取第3、4、5代病毒液進行血凝試驗測得其血凝價分別為1∶25、1∶27和1∶28。以上結(jié)果證明成功分離到PIV3，命名為JS2013。

2.3M基因序列比對與進化分析

使用兼并引物擴增M基因完整閱讀框序列，測序得到1 056 bp的編碼序列，將此M基因序列(GenBank accession No.KJ850331)與GenBank上不同基因型BPIV3毒株以及HPIV3的相應(yīng)基因序列進行相似性比對分析，其與BPIV3 SF株相似性最高，為80.2%；與HPIV3相似性最低，為77.4%。

進化分析結(jié)果表明JS2013具有獨特的基因特征，與BPIV3的3種基因型以及HPIV3均不同，形成獨立的分支(圖1)。氨基酸序列相似性高于核酸序列，最高為89.5%(表2)。核酸序列在不同位置均有較大變異(圖略)，氨基酸序列的變異集中在N端110aa部分(圖2)。

3 討 論

呼吸道疾病是危害養(yǎng)羊業(yè)，尤其是圈舍養(yǎng)殖山羊的重要疾病，但對相關(guān)致病病原的研究資料很少，已知的包括巴氏桿菌、支原體等，其他病毒性病原鮮有報道。在牛，BPIV3、呼吸道合胞病毒、傳染性鼻氣管炎病毒、腺病毒、呼吸道冠狀病毒等均與呼吸道疾病發(fā)生相關(guān)。其中BPIV3是危害肉牛養(yǎng)殖的重要病原之一，在應(yīng)激等刺激條件下引起嚴重的疾病，造成巨大的損失。近年來，國內(nèi)已有牛群中分離到BPIV3的報道。但羊群中PIV3的感染情況尚未有研究報道，國外的報道均較早[15-16]，對其中病原的基因特性及與BPIV3的關(guān)系未知。

表2 JS2013與BPIV3、HPIV3代表毒株核酸、氨基酸序列相似性

Table 2 Nucleotide and amino acid identity between JS2013 and BPIV3&HPIV3 reference strains

%

圖1 M基因序列進化分析結(jié)果Fig.1 Phylogenetic analysis based on the entire M gene sequences

圖2 M蛋白氨基酸序列比對結(jié)果Fig.2 Alignment of amino acid sequence of M protein

2013年下半年起江蘇多地山羊養(yǎng)殖場育肥山羊陸續(xù)出現(xiàn)以呼吸道癥狀為主的疾病，臨床表現(xiàn)較以往嚴重，藥物治愈率低，提示病原的特殊性。本實驗室通過不同地區(qū)羊場現(xiàn)場了解調(diào)查、剖檢采樣，對樣品中可能的相關(guān)病原(PIV3、ORSV、支原體、PPRV、牛冠狀病毒、FMDV)進行檢測。在所有羊場多數(shù)樣品中檢出PIV3，部分羊場少量樣品檢出ORSV和綿羊肺炎支原體，且所有羊場PIV3序列100%相似，提示PIV3是疾病發(fā)生的主要原因，而各個羊場不同的繼發(fā)感染造成臨床癥狀的差異。我們將進行人工感染試驗研究其對山羊、綿羊以及牛的致病性。當(dāng)然，也可能存在其他未知的致病病原，有待進一步鑒定。

Y.M.Zhu等提出M基因是對PIV3進行進化分析基因分型的最適靶基因[7]。本研究鑒定出的羊源PIV3與已報道毒株存在很大的差異，與BPIV3毒株最高僅為82%，與HPIV3最高僅為80%。為進一步分析其進化關(guān)系，通過比對BPIV3序列，設(shè)計擴增完整M基因的兼并引物，獲得序列進行分析，結(jié)果表明該毒株與BPIV3和HPIV3均具有顯著差異，且在進化上處于獨立的分支。因此，建議將其命名為羊副流感病毒3型。

目前病毒的全基因組序列正在測定中，有必要對羊群中PIV3以及其他病原流行分布情況進行系統(tǒng)的研究，這將為圈舍養(yǎng)殖條件下羊呼吸道疾病病原學(xué)研究奠定良好的基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

首次報道從發(fā)病羊中鑒定PIV3，并對其M基因序列進行測定，經(jīng)RT-PCR和血凝試驗檢測證實分離到病毒，命名為JS2013。擴增完整的M基因，進行進化分析表明該毒株不同于牛和人副流感病毒3型，具有獨特的基因特征。

致謝：感謝海安縣畜牧獸醫(yī)站孫銀華、丁永龍，南通點石生物科技有限公司黃加春在臨床病例資料整理、樣品采集方面提供的幫助支持。

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(編輯 白永平)

Isolation and Identification of Caprine Derived Parainfluenza Virus Type 3

LI Wen-liang1，MAO Li1，CHENG Su-ping2，WANG Qiu-sheng2，HUANG Jia-chun3， ZHANG Wen-wen1，YANG Lei-lei1，JIANG Jie-yuan1*

(1.KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnologyofMinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products，InstituteofVeterinaryMedicine，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China；2.Hai’ananimalhusbandryandveterinarystation，Hai’an226600，China；3.DianshibiologicaltechnologyCo.，Ltd.，Nantong226000，China)

From Aug 2013 to Mar 2014，fattened goat herds of many farms in Jiangsu province suffered severe respiratory disease.Serum and nasal swab samples were collected and subjected to pathogen detection.Parainfluenza virus type 3 (PIV3) was detected in most of the samples.Positive samples were inoculated onto Madin-Darby bovine kidney (MDBK) cells and passaged 5 times for virus isolation.A novel strain，named JS2013，was successfully isolated as identified by RT-PCR and hemagglutination test.Entire M coding region was amplified and sequenced.Phylogenetic analysis and comparison to other reference sequences available in GenBank indicated JS2013 was clearly distinct from other HPIV3 and BPIV3 strains.This is the first isolation and partial genetic identification of PIV3 from diseased goats.

parainfluenza virus type 3；goat；respiratory disease；Mgene；phylogenetic analysis

10.11843/j.issn.0366-6964.2015.02.024

2014-06-18

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(14)2090)

李文良(1984-)，男，河南開封人，副研究員，博士，主要從事動物傳染病防治和診斷技術(shù)研究，E-mail：kfliwenliang@163.com

*通信作者：江杰元，研究員，博士，Tel：025-84391135，E-mail：jieyuanj57@gmail.com

S852.659.5

A

0366-6964(2015)02-0344-05