積雪草酸衍生物的合成與表征及其抗腫瘤活性研究

王 楠， 張 萌， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

積雪草酸衍生物的合成與表征及其抗腫瘤活性研究

王 楠， 張 萌， 孟艷秋

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院， 遼寧 沈陽 110142)

以積雪草酸為原料，對其C-2，C-3，C-23和C-28位基團進行結構修飾，設計并合成3類共10個化合物，并經IR、MS、1H NMR確證其結構.采用MTT法研究部分積雪草酸衍生物對人胃腺癌細胞株SGC-7901，人非小細胞肺癌細胞株A549和人成纖維肉瘤細胞株HT-1080的體外細胞毒活性.結果顯示：化合物AA-Ⅲ2的IC50值較小，對上述3種細胞有較好的抑制作用，值得進一步研究.

積雪草酸； 五環三萜化合物； 合成； 抗腫瘤活性

積雪草酸(2α,3β,23-三羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酸)，又名亞細亞酸(asiatic acid,AA)，屬于烏蘇烷型骨架的五環三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤[1-2]、神經保護作用[3-4]、保護肝臟和腎臟[5-8]、抗炎[9]以及影響血管生成[10-11]等生物活性.因此，積雪草酸具有廣泛的開發前景.為了深入研究積雪草酸的結構與其抗腫瘤活性的關系，本文以積雪草酸為先導化合物，對其C-2、C-3、C-23位羥基和C-28位羧基等官能團進行結構修飾，設計并合成了3類共10個化合物，所合成化合物均未見文獻報道.采用MTT法，對部分積雪草酸衍生物進行體外細胞毒活性的藥理評價，為進一步研究積雪草酸的構效關系研究奠定了基礎.3條合成路線如下所示：

路線1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(酯、胺)類化合物合成

路線2N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類化合物的合成

路線3N-[1，2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類化合物的合成

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗所用試劑均為分析純或化學純，使用時根據需要進一步純化.反應所用溶劑按常規方法加以精制.以薄層色譜(TLC)檢測反應進程，薄層色譜用高效色譜硅膠GF254，柱層析色譜用200～300目柱色譜硅膠.在Buchi B-545熔點儀上測定化合物熔點，溫度未經校正.在Thermo Nicolet 470FT紅外光譜儀上測定(KBr壓片)紅外光譜.在菲尼根hermo-finnigan LCQ equipment儀上測定質譜.在Bruker ARX-500型核磁共振分析儀上測定核磁共振氫譜，CDCl3為溶劑，TMS為內標.

1.2 中間體的合成

1.2.1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸的制備(AA-Ⅰ)

將AA(200 mg,0.40 mmol)和對甲基苯磺酸(34 mg,0.20 mmol)，溶解在DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，然后滴加2,2-二甲氧基丙烷(1.0 mL,4.0 mmol)，在室溫下攪拌，反應完畢，用質量分數5 %的氫氧化鈉溶液調節pH至7～8，混合物用乙酸乙酯提取，有機層用蒸餾水及飽和氯化鈉溶液洗滌，無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體AA-1.m.p.156.4～157.8 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：3 400，1 698，1 200 cm-1.

再將硅膠負載PDC(重鉻酸吡啶钅翁,160 mg)加入到二氯甲烷中，加入0.2 mL乙酸酐攪拌30 min，而后將此溶液加到化合物AA-1的二氯甲烷溶液中，回流2 h.反應結束后，過濾除去硅膠，濾液減壓蒸出溶劑，再溶于30 mL乙酸乙酯，攪拌30 min，用水萃取，有機相用無水Na2SO4干燥，抽濾除去干燥劑，旋蒸得到粗品.粗品經柱層析提純后得化合物AA-2.1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：5.24(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H),0.90(d,3H,J=6.0 Hz),0.86(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：527.4(M+H)+.

將化合物AA-2用無水乙醇溶解，按摩爾比1∶1∶1.2的比例分別加入AA-2、乙酸鈉和鹽酸羥胺，在78 ℃下回流，TLC檢測反應終點.然后蒸干溶劑，充分水洗，過濾，濾餅洗至中性，再用甲醇溶解，并加入1 mol/L的鹽酸數滴，在室溫下攪拌3 h，反應結束后，蒸除溶劑，剩余混合物用乙酸乙酯提取，有機層用無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體，粗品用硅膠柱色譜純化，得產物AA-Ⅰ(36 mg).IR(KBr)，σ/cm-1：1 379,1 696,2 925,3 422.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.52(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.43(s,1H,H-9),2.14(d,1H,J=10.8 Hz,H-18),1.33,1.25,1.12,1.09,1.04,0.80(s,each 3H).ESI-MS,m/z：502.4(M+H)+.

1.2.2 2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(AA-Ⅱ)的制備

將化合物AA-2用適量吡啶溶解，按摩爾比1∶2的比例分別加入化合物AA-2和鹽酸羥胺，115 ℃下回流，TLC檢測.反應結束后，冷卻至室溫，再加入冰水抽濾，水洗濾餅至中性，經柱層析分離后得固體AA-Ⅱ(48 mg).IR(KBr),σ/cm-1：1 049，1 275,1 695,2 924,3 419.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=10.8 Hz,H-23),3.51(s,1H,H-3),3.46(d,1H,J=10.8 Hz,H-23),2.42(s,1H,H-9),2.14(d,1H,J=10.6 Hz,H-18),1.35,1.33,1.13,1.06,1.04,0.98,(s,each 3H),0.92(d,3H,J=6.0 Hz),0.87(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：542.4(M+H)+.

1.2.3 1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(AA-Ⅲ)的制備

將化合物AA-2用甲酸乙酯溶解，加入少量甲醇鈉，室溫下反應24 h，用TLC跟蹤檢測確定反應終點.減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和水萃取，有機相用無水Na2SO4干燥，抽濾除去干燥劑，旋蒸.將粗品溶解在4 mL二氯甲烷中，加入少量鹽酸羥胺，室溫攪拌，用TLC跟蹤檢測確定反應終點.混合物用乙酸乙酯提取，有機層用蒸餾水及飽和NaCl溶液洗滌，無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體.然后將固體溶解在甲醇中，加入1 mol/L鹽酸數滴，攪拌3 h.減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯和水萃取，旋蒸后的粗品經柱層析得產物AA-Ⅲ.IR(KBr),σ/cm-1：525,1 255,2 492，2 678,2 739cm-1.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.26(s,1H,H-12),3.62(d,1H,J=10.6 Hz,H-23),3.60(s,1H,H-3),3.46(d,1H,J=10.6 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.20(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),2.04(s,1H),1.29,1.16,1.14,1.09,0.96,0.88(s,each 3H).ESI-MS,m/z：512.3(M+H)+.

1.3 目標化合物的合成

1.3.1 2-肟基-3,23-二羥基-烏蘇烷型-12-烯-28-羧酸酯類化合物(AAI1～I3)的制備

1.3.1.1 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-乙酯(AA-Ⅰ1)的制備

將化合物AA-Ⅰ(50 mg,0.099 8 mmol)溶解在4 mL DMF中，加入催化劑量的碳酸鉀，再滴入溴乙烷(0.028 mL,0.380 mmol)，室溫攪拌，用TLC跟蹤檢測確定反應終點.混合物用乙酸乙酯提取，有機層用蒸餾水及飽和氯化鈉溶液洗滌，無水MgSO4干燥，抽濾，減壓蒸餾得白色固體，粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ1(22 mg).m.p.210.7～211.6 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 040,1 453,1 667,2 926,3 425.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),4.30(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),4.06(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.61～3.67(m,2H,OCH2),3.50(s,1H,H-3),2.00(s,1H,NOH),1.42～1.43(t,3H,CH3),1.26,1.11,0.95,0.87,0.76,0.69(s,each 3H).ESI-MS,m/z：530.5(M+H)+.

1.3.1.2 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-丙酯(AA-Ⅰ2)的制備

按照化合物AA-Ⅰ1的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和溴代正丙烷反應.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ2(18 mg).IR(KBr),σ/cm-1：1 052,1 454,1 662,2 927,3 417.m.p.213.2～214.1 ℃.1H NMR(500 MHz,CDCl3)，δ：5.27(s,1H,H-12),4.28～4.32(t,2H,OCH2—),4.08(d,1H,J=8.5 Hz,H-23),3.94(d,1H,J=8.5Hz,H-23),3.33(s,1H,H-3),2.38(s,1H,H-9),2.26(d,1H,J=9.0 Hz,H-18),2.00(s,1H,NOH),1.25,1.11,0.94,0.76(s,each 3H),1.61～1.63(m,2H,—CH2—),0.95～0.96(t,3H,—CH3).ESI-MS，m/z：544.3(M+H)+.

1.3.1.3 2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-丁酯(AA-Ⅰ3)的制備

按照化合物AA-Ⅰ1的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和溴代正丁烷反應.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=6/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅰ3(16 mg).IR(KBr),σ/cm-1:1 046,1 454,1 661,2 927,3 420.m.p.222.5～224.3 ℃.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),4.08～4.16(t,2H,OCH2—),3.84(d,1H,J=10.0 Hz,H-23),3.58(d,1H,J=10.0 Hz,H-23),3.35(s,1H,H-3),2.43(d,1H,J=10.0 Hz,H-18),2.36(s,1H,H-9),1.74～1.76(m,2H,—CH2a—),1.48～1.51(m,2H,—CH2b—),1.34,1.23,1.21,0.91,0.87,0.85(s,each 3H),0.96～0.98(t,3H,—CH3).ESI-MS，m/z：573.7(M+NH3)+.

1.3.2N-2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-胺類化合物(AAI4～I6)的制備

1.3.2.1N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-苯胺(AA-Ⅰ4)的制備

將化合物AA-Ⅰ(50 mg，0.099 8 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯((COCl2)，0.4 mmol)，室溫攪拌20 h，生成2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰氯，蒸除反應溶劑和未反應的草酰氯，殘余物加入2 mL環己烷，減壓蒸除環己烷，反復操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調節pH為9～10，攪拌5 min后，加入苯胺(32 mg,0.4 mmol)，室溫下反應，TLC監測反應終點.反應結束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調pH至3～4，析出黃色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得化合物AA-Ⅰ4(15 mg).m.p.184.0～184.9 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 502,1 388,1 678,2 926,3 417.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.43(d,2H,2CHa),7.19(d,1H,CHb),7.23(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.76(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.21(s,1H,H-3),3.40(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS,m/z：574.0(M+H)+.

1.3.2.2N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-環己胺(AA-Ⅰ5)的制備

按照化合物AA-Ⅰ4的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和環己胺制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得黃色固體AA-Ⅰ5(13 mg).m.p.182.5～183.4 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：602,1 040,1 637,2 924,3 445.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：5.27(s,1H,H-12),3.76(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),3.14(s,1H,H-3),3.40(d,1H,J=7.0 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.18,1.13,0.96,0.89,0.88(s,each 3H).ESI-MS,m/z：568.8(M+H)+.

1.3.2.3N-[2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-芐胺(AA-Ⅰ6)的制備

按照化合物AA-Ⅰ4的合成方法，由化合物AA-Ⅰ和芐胺制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得黃色固體AA-Ⅰ6(14 mg).m.p.185.7～186.8 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 025,1 454,1 651,2 927,3 282.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.33(m,2H,2CHb),7.23～7.26(m,3H,CHa),5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.32,1.14,1.11,1.04,0.99,0.84(s,each 3H).ESI-MS,m/z：591.4(M+H)+.

1.3.3 2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-氨基醇類化合物的(AAⅡ1～Ⅱ2)制備

1.3.3.1N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-3-氨基-1-丙醇(AA-Ⅱ1)的制備

將化合物AA-Ⅱ(50 mg,0.092 4 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.4 mmol)，室溫攪拌20 h，生成2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰氯，蒸除反應溶劑和未反應的草酰氯，殘余物加入2 mL環己烷，減壓蒸除環己烷，反復操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調pH為9～10，攪拌5 min后，加入3-氨基-1-丙醇(30 mg,0.4 mmol)，室溫下反應，TLC監測反應終點.反應結束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調pH至3～4，析出白色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.室溫干燥得粗品，經硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=4/1，得白色粉末狀固體AA-Ⅱ1(19 mg).m.p.234.3～235.2 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 064,1 655,1 726，2 937,3 420.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.04(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.83～3.86(m,1H,NCH),3.77(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.34(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.25(d,2H,J=9.2 Hz,CH2O),2.23(d,1H,J=11.0 Hz,H-18),1.32(d,3H,J=8.4 Hz,CH3),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H),0.92(d,3H,J=6.4 Hz),0.87(d,3H,J=6.4 Hz),0.92(d,3H,J=6.0 Hz),0.87(d,3H,J=6.0 Hz).ESI-MS,m/z：598.4(M+H)+.

1.3.3.2N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-2-氨基-2-甲基乙醇(AA-Ⅱ2)的制備

按照化合物AA-Ⅱ1的合成方法，由化合物AA-Ⅱ和2-氨基-1-丙醇制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得白色固體AA-Ⅱ2(18 mg).m.p.230.5～232.1 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 064,1 655,1 726，2 937,3 420.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.03(s,1H,NH),5.27(s,1H,H-12),3.24～3.26(t,1H,NCH2),3.77(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.34(d,1H,J=9.6 Hz,H-23),3.50(t,2H,CH2O),3.25(d,2H,J=9.2 Hz,CH2O),2.23(d,1H,J=11.0 Hz,H-18),1.58(m,2H,—CH2—),1.22,1.15,1.11,1.04,0.98,0.78(s,each 3H),1.14(d,3H,J=5.7 Hz),0.92(d,3H,J=6.3 Hz).ESI-MS,m/z：598.3(M+H)+.

1.3.4N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇乙酸酯類化合物(AAⅢ1～Ⅲ2)的制備

1.3.4.1N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-3-氨基-1-丙醇乙酸酯(AA-Ⅲ1)的制備

將化合物AA-Ⅲ(100 mg,0.092 4 mmol)溶解在4 mL二氯甲烷中，加入草酰氯(0.4 mmol)，室溫攪拌20 h，蒸除反應溶劑和未反應的草酰氯，殘余物加入2 mL環己烷，減壓蒸除環己烷，反復操作2次.酰氯中加入2 mL二氯甲烷使之完全溶解后，加三乙胺調pH為9～10，攪拌5 min后，加入3-氨基-1-丙醇(30 mg,0.4 mol/L)，室溫下反應，TLC監測反應終點.反應結束后，減壓蒸除二氯甲烷，向反應液中加入2 mL水，以2 mol/L鹽酸調pH至3～4，析出淡黃色固體，迅速減壓抽濾，水洗濾餅至中性.室溫干燥得粗品淡黃色固體AA-4.

將經過硅膠柱提純的固體AA-4溶于二氯甲烷中，加入乙酸酐及少量DMAP(二甲氨基吡啶)，室溫下攪拌，反應完畢，蒸出溶劑，加入3 mL水分散固體，以2 mol/L鹽酸調pH至3～4，抽濾，水洗至中性，室溫干燥得淡黃色粉末狀固體AA-Ⅲ1(13 mg).m.p.213.6～214.7 ℃.IR(KBr),σ/cm-1：1 036,1 724,2 928,3 872.1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：8.11(s,1H,NH),7.83(s,1H,N==CH),5.27(s,1H,H-12),3.54(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.48(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.12～3.20(t,2H,NCH2),2.40(s,1H,H-9),2.22(s,3H,CH3),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS，m/z：629.0(M+H2O)+.

1.3.4.2N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-2-氨基-2-甲基乙醇乙酸酯(AA-Ⅲ2)的制備

按照化合物AA-Ⅲ1的合成方法，由化合物AA-Ⅲ和2-氨基-1-丙醇制備而成.粗品用硅膠柱色譜純化，洗脫劑為V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=3/1，得淡黃色粉末狀固體AA-Ⅲ2(14 mg).m.p.214.1～214.9 ℃.IR(KBr)，σ/cm-1：1 140,1 455,1 758,2 928,3 422 .1H NMR(500 MHz,CDCl3),δ：7.83(s,1H,N==CH),5.27(s,1H,H-12),4.49～4.51(t,2H,CH2O),3.52(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),3.50(s,1H,H-3),3.44(d,1H,J=11.2 Hz,H-23),2.40(s,1H,H-9),2.24(s,3H,CH3),2.17(d,1H,J=11.2 Hz,H-18),1.25,1.15,1.13,1.04,0.98,0.75(s,each 3H).ESI-MS,m/z：629.4(M+H2O)+.

1.4 初步體外細胞毒活性測試

選用人胃腺癌細胞株SGC-7901，人非小細胞肺癌細胞株A549和人成纖維肉瘤細胞株HT-1080為靶細胞，采用四唑鹽比色法即MTT法，對化合物AA、AA-Ⅰ1、AA-Ⅰ5和AA-Ⅲ2進行體外細胞毒活性測試.

1.4.1 埋板

將生長至對數生長期的細胞消化、離心，制成細胞懸液，吹勻并將SGC-7901、A549、HT-1080三種細胞其密度分別調至2×104個/mL、2.5×104個/mL、1×104個/mL，以180 μL/孔接種到96孔板中，加的過程中不斷吹勻細胞，保證細胞密度一致，鋪板過程要迅速，保證每孔的細胞數目大致相同，將96孔板置于37 ℃、含5 %的CO2、飽和濕度的培養箱中孵育24 h.

1.4.2 加藥

將藥物配制成以完全培養基為溶劑，初始質量濃度為1 g/L的溶液，將上述溶液稀釋成5個劑量組，藥物的質量濃度分別為500,50, 5，0.5，0.05 mg/L.取各個劑量的藥液加入96孔板中，每孔20 μL，每劑量3個復孔.加藥后的藥物終濃度分別為50，5，0.5，0.05，0.005 mg/L.加藥完畢放入培養箱中孵育72 h.

1.4.3 MTT檢測

將加藥并于培養箱中孵育48 h后的96孔板中培養基輕輕甩出，然后加入配置好的MTT溶液(5 g/L)，每孔20 μL，放入培養箱中繼續孵育3 h.取出孵育3 h的96孔板，將其中的MTT溶液輕輕甩出，每孔加100 μL的DMSO，微量振蕩儀上振蕩5 min以使甲瓚完全溶解，用酶標儀在490 nm下測光密度(OD)值，并記錄數據.按下列公式計算藥物對腫瘤細胞體外增殖的抑制率(Inhibition Rate，IR)：

用IC50計算軟件來計算半數抑制濃度(IC50).

2 結果與討論

2.1 化學合成

以積雪草酸為起始原料，合成了2-肟基-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-羧酸(酯、胺)類、N-[2-肟基-3β,23-O-異亞丙基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇類和N-[1,2-駢噁唑-3β,23-二羥基-烏蘇烷-12-烯-28-酰]-氨基醇乙酸酯類3類共10個化合物，均未見文獻報導，其結構通過IR、MS和1H NHR得以確認.

2.2 生物活性評價

采用四唑鹽比色法即MTT法對化合物的抗腫瘤活性進行篩選.實驗結果見表1和表2.由表1、表2數據可知：積雪草酸衍生物對三種腫瘤細胞有一定抑制作用.其中化合物AA-Ⅲ2在50 mg/L質量濃度中，對于SGC-7901、HT-1080、A549的抑制率分別為93.06 %，96.85 %，95.52 %，明顯優于對照品吉非替尼(73.25 %，85.01 %，68.15 %)，與阿霉素的抑制活性基本相同，甚至對于A549腫瘤細胞抑制作用要強于阿霉素(90.25 %).而化合物AA-Ⅰ1，AA-Ⅰ5在50 mg/L質量濃度中，對于SGC-7901、HT-1080、A549的抑制率相對較低，具有較弱的抑制活性.化合物AA-Ⅲ2(IC50：12.395 μmol/L,13.293 μmol/L)對SGC-7901、HT-1080的細胞毒性與吉非替尼(10.527 μmol/L,12.998 μmol/L)相當，其中對A549(8.052 μmol/L)的細胞毒性明顯優于吉非替尼(23.496 μmol/L)，并且AA-Ⅲ2和AA相比，對于A549、HT-1080兩種腫瘤細胞有著明顯的優勢.

表1 化合物在不同質量濃度下對三種細胞株的抑制率

表2 化合物的IC50值

3 結 論

初步的構效關系表明：28位成氨基醇乙酸酯對SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細胞的抗腫瘤活性明顯增強，如AA-Ⅲ2≈阿霉素>>吉非替尼，甚至對于A549抑制作用要略高于阿霉素；28位成酯的衍生物，對SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細胞的抗腫瘤活性要高于28位成酰胺的衍生物，如AA-Ⅰ1>AA-Ⅰ5；1位成肟可能對積雪草酸對SGC-7901、A549、HT-1080三種腫瘤細胞的抗腫瘤活性起到了抑制作用，如AA>> AA-Ⅰ1>AA-Ⅰ5，而1,2位駢成噁唑環可能對積雪草酸的抗腫瘤尤其是對A549細胞起到了促進作用，如AA-Ⅲ2>>AA.

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Synthesis and Characterization of Asiatic Acid Derivatives and Its Anti-tumor Activities

WANG Nan, ZHANG Meng, MENG Yan-qiu

(Shenyang University of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)

Natural active product is an important source of anti-cancer drugs.Through C-2,C-3,C-23 and C-28 for structural modification,three types of ten new compounds of asiatic acid derivatives were designed and synthesized.The target compounds were not reported,and confirmed its structure by IR,MS,1H NMR.Anti-tumor activities of asiatic acid and these derivatives against SGC-7901,A549 and HT-1080 cells in vitro were investigated by MTT assay.The results indicated that compound AA-III2had stronger cell growth inhibitor than other products.It is worth to be intensively further studies.

asiatic acid; pentacyclic triterpenoid; synthesis; anti-tumor activity

2014-02-27

王楠(1987-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生在讀，國家獎學金獲得者，主要從事五環三萜類天然產物結構改造及其抗癌活性的研究.

孟艷秋(1963-)，女，遼寧義縣人，教授，博士，主要從事天然化合物有效成分結構改造及抗癌活性和新型半合成抗生素方面的研究.

2095-2198(2015)03-0242-07

10.3969/j.issn.2095-2198.2015.03.011

R914.5

A