肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎的影響

牛春麗，曾 菁，夏盟愷，彭 芳

（大理學院藥學與化學學院，云南大理 671000）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病中的一種，迄今為止UC 的病因、機制仍未明確，可能與遺傳、免疫、感染、精神心理等因素有關，UC 的治療主要在于炎癥的控制，目前臨床常用的藥物多依賴氨基水楊酸類、腎上腺皮質激素等對機體不良反應多的藥物，現有藥物的不良反應表現為易出現肝腎毒性，極易產生耐藥性及潛在致畸等。隨著中藥研究的進一步發展，中藥治療UC 發揮著越來越重要的作用，康復新液作為美洲大蠊干燥蟲體的乙醇提取物在以往的研究中對UC的作用已得到了肯定〔1-3〕，本研究立足美洲大蠊的另外制品，旨在進一步開發出更多對UC高效低毒的藥物。本實驗研究的肝龍膠囊是采用現代提取分離技術所獲得的美洲大蠊另一有效成分，為了探討此有效成分在消化系統方面是否有效果，所以本實驗觀察了其對動物性結腸炎的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物BALB/C小鼠購自重慶騰鑫科技有限公司，雌雄各半，體重18～22 g，合格證號：SCXK（渝）2012-0003。

1.2 受試藥品及試劑肝龍膠囊（賽諾制藥公司，批號：國藥準字Z20050113）；康復新液（賽諾制藥公司，批號：國藥準字Z53020054）；美洲大蠊脫脂膏（由大理學院藥學與化學學院劉光明教授提供，批號：20110906）。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，MP Biomedicals生產，合格號：0216011080）；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒（南京建成生物工程研究所生產，批號：20131018）；α-腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）免疫組化試劑盒（中杉金橋生物公司，批號：20110801）；生理鹽水（normal saline，NS）（昆明南疆制藥有限公司生產，批號：200803156）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及實驗方法 將90只小鼠隨機分為正常對照組，模型組，陽性對照組（康復新液0.36 mg/kg），肝龍膠囊高劑量組（100 mg/kg）、中劑量組（50 mg/kg）、低劑量組（25 mg/kg）；美洲大蠊脫脂膏高劑量組（200 mg/kg）、中劑量組（100mg/kg）、低劑量組（50mg/kg）。除正常組之外，其它組都給予3%DSS溶液自由飲用10 d〔4-6〕。飲用3%DSS第1天起，陽性對照組、肝龍膠囊組和美洲大蠊脫脂膏組按0.2 mL/10 g灌胃給藥，1 次/d，連續10 d。模型組和正常對照組按0.2 mL/10 g灌胃NS，1 次／d，連續10 d。以上各組動物均置于代謝籠內飼養每天觀察并記錄小鼠體重、大便性狀、皮毛及精神狀態等，并計算疾病活動指數（disease activity index ，DAI）〔7〕。實驗第10 天給藥后3 h處死小鼠，取結腸遠端距肛門4 cm 至回盲部腸段，觀察并記錄所得結腸長度，沿腸系膜緣縱行剖開，稱取乙狀結腸段粘膜50 mg，將小鼠結腸組織在冰浴下制成5%勻漿（或-80 ℃保存，備用），按MPO試劑盒說明測定其含量。留取剩余結腸標本（2 mm×10 mm），20%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片、HE 染色。結腸組織TNF-α的檢測采用免疫組化法檢測〔8-10〕。DAI評分標準見表1。

表1 DAI評分標準

1.3.2 免疫組化圖像分析法 平均光密度是醫學圖像分析中的一個重要指標，在離散圖像中每一個小區域由一個樣本點表示，每一個樣本點被稱為一個像素，每一個像素的明亮程度即代表這個區域的平均灰度，被稱為像素的平均灰度。在醫學圖像定量分析中常用平均光密度來表示，平均光密度與平均灰度之間可用公式計算〔11-12〕。免疫組化切片中陽性區的表達的強弱與光密度值呈正相關，與灰度值呈負相關。使用Image J圖像分析軟件，打開所需分析的免疫組化圖片，在Analyze 菜單中選取Set Measurements，從中選擇平均灰度，對選擇的陽性染色區域進行測定，結果直接登錄到Excel表中，進行計算得出平均光密度值后統計分析。計算公式為：

OD:平均光密度；Io:入射光強度，空白視野的平均灰度值；Ii:透射光強度，被測物體的平均灰度值。

2 結果

2.1 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎結腸長度的影響由表2 可見，對小鼠結腸長度的影響：所有飲用3%DSS的各組小鼠結腸長度都出現了不同程度的縮短，與NS組比較，模型組縮短最多（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏3 個劑量組，肝龍膠囊低劑量組顯著性縮短（P＜0.01），肝龍膠囊中劑量組縮短較少（P＜0.05），肝龍膠囊高劑量組，康復新液組與NS組比較縮短差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，NS 組，康復新液組，肝龍膠囊高、中劑量組顯著性增長（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏低劑量組增長較少（P＜0.05）；與康復新液組比較，模型組，美洲大蠊脫脂膏高劑量及中劑量組顯著性縮短（P＜0.01），肝龍膠囊低劑量組縮短較少（P＜0.05），肝龍膠囊高、中劑量組，美洲大蠊脫脂膏低劑量組與康復新液組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎結腸長度的影響（±s，n=10）

表2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎結腸長度的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復新液劑量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36結腸長度/cm 6.22±0.66(正常)4.36±0.40**△△5.59±0.42##5.48±0.88*##4.99±0.70**△4.41±0.49**△△4.65±0.75**△△5.09±0.39**#5.69±0.98##

2.2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎DAI 的影響由表3 可見，肝龍膠囊對小鼠DAI的影響：與NS組比較，飲用3%DSS各組都有不同程度的增大，其中模型組增大最多（P＜0.01），肝龍膠囊3 個劑量組、美洲大蠊脫脂膏3 個劑量組顯著性增大（P＜0.01），康復新液組與NS 組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）；與模型組比較，各組DAI 顯著性增大（P＜0.01）；與康復新液組比較，模型組，肝龍膠囊中、低劑量組及美洲大蠊脫脂膏中、低劑量組顯著性增大（P＜0.01），肝龍膠囊高劑量組增大較少（P＜0.05），美洲大蠊脫脂膏高劑量組與康復新液組比較差異無統計學意義（P ＞0.05）。DAI 描述的是體重下降、稀便、大便隱血3 種結腸炎炎癥活動的活躍情況，所以DAI 值的大小與結腸炎嚴重程度呈正相關。

表3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎DAI的影響（±s，n=10）

表3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎DAI的影響（±s，n=10）

注: 與 NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復新液劑量/（mg/Kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 DAI 0.57±0.19 3.47±0.40**△△1.47±0.60**##△2.20±0.52**##△△2.24±0.67**##△△1.37±0.50**##2.10±0.43**##△△2.27±0.54**##△△0.93±0.68##

2.3 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎MPO含量的影響由表4可見，對小鼠MPO含量的影響：與NS 組比較，模型組增加顯著（P＜0.01），美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組、康復新液組MPO 含量與NS 比較差異都沒有統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，肝龍膠囊高劑量組MPO 含量顯著性減少（P＜0.01），肝龍膠囊中、低劑量組，美洲大蠊脫脂膏中劑量組及康復新液組MPO 含量減少（P＜0.05），美洲大蠊脫脂膏高、低劑量組與模型組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與康復新液組比較，只有模型組MPO 含量增加（P＜0.05）。美洲大蠊脫脂膏各劑量組未出現明顯的藥物濃度依賴性。

表4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎MPO含量的影響（±s，n=10）

表4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎MPO含量的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與陽性組比較，△P＜0.05。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復新液劑量/（mg/kg）100.00 50.00 25.00 200.00 100.00 50.00 0.36 MPO 含量/（U/g）0.26±0.12 0.86±0.38**△0.38±0.19##0.45±0.25#0.51±0.16#0.52±0.15 0.44±0.24#0.55±0.21 0.52±0.17#

2.4 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎組織病理學的影響由圖1可見：飲用3%DSS各組小鼠病理學檢查都出現了不同程度的炎性細胞浸潤以及腺體消失等現象，其中模型組炎性細胞浸潤明顯、也出現了大量的腺體、空杯細胞消失，而各藥物組的UC 現象都得到了一定的改善，其中肝龍膠囊高劑量組、美洲大蠊脫脂膏低劑量組和康復新液組都保持了較為完整結腸結構。

圖1 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎組織病理學的影響

2.5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎TNF-α免疫組化的影響將各組解剖所得結腸段用20%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，用TNF-α免疫組化試劑盒對切片進行脫蠟、顯色，以觀察各組TNF-α表達量。

TNF-α陽性表達一般發生在細胞漿，顏色因表達強度由弱至強呈淺黃至深褐色。由圖2 可見：整個視野細胞漿呈深褐色，表現出較強的陽性表達，NS 組整個視野細胞漿呈藍色，未見陽性表達，而其它各組陽性面積較模型組比較都大大縮小，且顏色深度亦較淺。美洲大蠊、肝龍膠囊各劑量組和康復新液組都表現出了不同的陽性率。運用Image J 軟件法對每組切片的陽性表達區域進行測定得出其平均灰度值，并進行計算得到平均光密度值，平均光密度值與TNF-α表達強度呈正相關。見表5。

圖2 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎TNF-α的影響

由表5 可見，對小鼠TNF-α免疫組化平均光密度的影響：與NS 組比較，模型組增加最多（P＜0.01），肝龍膠囊高、中劑量組和美洲大蠊脫脂膏低劑量組顯著性增加（P＜0.01），康復新液組，美洲大蠊高、中劑量組及肝龍膠囊低劑量組與NS 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，各組平均光密度都顯著性減小（P＜0.01）；與康復新液組比較，只有模型組顯著性增加（P＜0.01）。

表5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎TNF-α免疫組化平均光密度的影響（±s，n=10）

表5 肝龍膠囊及美洲大蠊脫脂膏對小鼠急性結腸炎TNF-α免疫組化平均光密度的影響（±s，n=10）

注:與NS 組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與陽性組比較，△△P＜0.01。

組別NS模型組肝龍膠囊高劑量組肝龍膠囊中劑量組肝龍膠囊低劑量組美洲大蠊脫脂膏高劑量組美洲大蠊脫脂膏中劑量組美洲大蠊脫脂膏低劑量組康復新液劑量（mg/Kg）100 50 25 200 100 50 0.36平均光密度0.018±0.002 0.107±0.043**△△0.044±0.013**##0.048±0.008**##0.034±0.009##0.037±0.009##0.036±0.005##0.045±0.017**##0.034±0.012##

3 討論

本研究結果提示，肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對于DSS 所致小鼠急性UC 有一定的粘膜保護作用。與模型組比較，肝龍膠囊組、美洲大蠊脫脂膏組結腸長度增長，表明肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏能減輕結腸粘膜破損、固有結構喪失以及瘢痕生成等UC 炎癥反應，保護小鼠結腸粘膜；與模型組比較，肝龍膠囊組、美洲大蠊脫脂膏組DAI 顯著性減小（P＜0.01），表明肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏能減輕UC 癥狀的嚴重程度。MPO 含量檢測中，美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組與康復新液組比較不存在統計學意義，且出現了表達量低于康復新液組的趨勢。在TNF-α免疫組化檢查中，美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組與康復新液組平均光密度比較亦不存在統計學意義，這說明美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組TNF-α表達強度與康復新液組相當，表明美洲大蠊脫脂膏、肝龍膠囊各劑量組對急性UC 可能產生了與康復新液組相當的改善作用。由實驗結果推測，肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對DSS所致小鼠急性UC的保護作用可能與抑制中性粒細胞MPO 的釋放和降低結腸組織中TNF-α表達量有關。

UC 的病理改變主要表現為固有膜內彌漫性炎性細胞浸潤，而急性UC主要為中性粒細胞浸潤，另外可見腺體、杯狀細胞減少等現象。通過本實驗的病理切片觀察，模型組小鼠的病理組織切片出現彌漫性的炎性細胞浸潤，且固有的結構破壞；陽性藥及其它各給藥組粘膜炎性細胞與模型組比較浸潤程度不同程度地減少，排列緊密，且結構基本保持完整。肝龍膠囊、美洲大蠊脫脂膏對DSS所致急性UC 有一定的保護作用，其作用可能與抑制中性粒細胞MPO 的釋放和降低結腸組織中TNF-α含量有關。本次實驗結果為以美洲大蠊為原料的藥品治療急性UC提供了一定的理論依據。

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