HCY-2在正常人胚呼吸系統中的表達

張元元，李耀康，王光明

（大理學院臨床醫學院，云南大理 671000）

同型半胱氨酸誘導基因（Homocysteine induced gene，HCY-2）是北京大學醫學部心血管研究所在研究同型半胱氨酸處理血管平滑肌而克隆的新基因〔1-2〕，目前形態學研究證實HCY-2 表達廣泛在成年大鼠的心臟、腎臟等組織中存在〔3〕，它在畸形人胚心臟中的表達發生異常〔4〕，而進一步研究顯示在同型半胱氨酸誘導培養心肌細胞時，HCY-2的表達變化與細胞增殖改變密切相關〔5〕，但是HCY-2基因在呼吸系統中的表達以及HCY-2 基因表達異常與呼吸系統畸形的關系未見報道。為探討該基因在人胚呼吸系統中的分布，我們探討HCY-2在正常發育的人胚呼吸道中的表達變化，以揭示HCY-2基因在人呼吸系統發育中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料HCY-2 抗體來源于北京大學醫學部心血管研究所。正常人胚（以受精齡計算胎齡）：4～8周人胚6例（早期），3～4月人胚5例（中期），5～6個月人胚5 例（晚期），8 月以上人胚4 例（近足月）；以上人胚均取材自北京大學第三附屬醫院和平里醫院等，所有胚胎因某種原因流產后均已死亡。

1.2 方法

1.2.1 人胚氣管和肺的獲得 取正常發育不同時期的氣管和肺，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，以5 μm厚度進行組織切片。

1.2.2 免疫組織化學ABC 法 為顯示正常發育人胚不同時期氣管和肺內HCY-2的表達，按照免疫組織化學ABC 法進行染色。具體步驟：0.01 M KPBS清洗5 min×3 后；0.3%的過氧化氫甲醇溶液（甲醇80 mL+0.01 M KPBS 100 mL+30%過氧化氫）30 min，0.01 M PBS 清洗 5 min×3；0.3% Triton X100（30%Triton X100+0.01 M KPBS 100 mL）30 min，0.01 M KPBS 清洗 5 min×3；加入抗 HCY-2 抗體濃度為1：800（體積比），陰性對照組用PBS 代替抗HCY-2 抗體，4 ℃存放24 h；吸去抗體，0.01 M KPBS 洗5 min×3；加入0.01 M KPBS 稀釋的二抗，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS 洗5 min×3；加入ABC 復合物抗體，室溫孵育2 h，0.01 M KPBS 洗5 min×3；蒸餾水迅速沖3 次；加入顯色液，進行免疫組織化學顯色；梯度酒精脫水之后，封片。

1.2.3 HCY-2 表達的半定量分析及統計學處理用Q-500 圖像分析系統檢測HCY-2 在正常發育不同時期的人胚氣管和肺中的表達變化灰度值，同時測定本底值，然后換算為光密度值（OD）。每個樣本分析3 張切片，每張切片隨機隨機選取3 個視野進行分析。各組的HCY-2 表達用（±s）表示。首先用SPSS10.0統計軟件中的One-way ANOVA 模塊進行分析，有統計學意義后再用Scheffle post hoc 進行組間處理。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HCY-2在胚胎時期肺內的表達同型半胱氨酸誘導基因在人體胚胎肺發育的整個時期均有表達，其陽性產物分布于肺和各級支氣管的上皮及其氣管腺的腺上皮細胞的細胞漿內。見表1及圖1。根據陽性反應強度不同而呈淺黃色、黃色或者是深棕色，HCY-2在妊娠早期和妊娠中期的表達最強，見圖1A及圖1B，然后在妊娠晚期的表達下降，見圖1C，在近足月的人胚肺內表達最弱，見圖1D，妊娠晚期和近足月組與妊娠早期和中期比較，組間兩兩比較差異均具有統計學意義（P=0.000 01），近足月組與妊娠晚期組比較，差異具有統計學意義（P=0.000 01）。

表1 正常人胚肺內HCY-2免疫反應陽性物含量（±s）

表1 正常人胚肺內HCY-2免疫反應陽性物含量（±s）

注：與妊娠早期和中期比較**P＜0.01；與妊娠晚期比較$$P＜0.01。

發育不同時期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片數18 15 15 12檢測單位面積54 45 45 36 HCY-2/單位面積0.389±0.028 0.395±0.029 0.215±0.039**0.174±0.037**，$$

圖1 妊娠期肺內HCY-2的表達

2.2 HCY-2在胚胎時期氣管中的表達HCY-2在人體胚胎氣管發育的整個時期均有表達，其陽性產物主要分布于氣管上皮和氣管腺腺細胞的胞漿內，以及氣管管壁內的透明軟骨中軟骨細胞的細胞核內。見表2 及圖2）。根據陽性反應強度不同，HCY-2在近足月胚胎的氣管中表達最強，見圖2D，然后在妊娠早期和晚期的表達逐漸下降見圖2B及圖2C，在妊娠中期的人胚氣管中表達最弱，見圖2B，與妊娠早期比較，組間兩兩比較差異均具有統計學意義（P=0.00），與妊娠中期比較，差異均具有統計學意義（P=0.00），近足月組與妊娠晚期組比較差異有統計學意義（P=0.00）。

表2 正常人胚氣管內HCY-2免疫反應陽性物含量（±s）

表2 正常人胚氣管內HCY-2免疫反應陽性物含量（±s）

注：與妊娠早期比較**P＜0.01；與妊娠中期比較$$P＜0.01；與妊娠晚期比較##P＜0.01。

發育不同時期妊娠早期妊娠中期妊娠晚期近足月切片數18 15 15 12檢測單位面積54 45 45 36 HCY-2/單位面積0.301±0.029 0.219±0.029**0.251±0.032**，$$0.344±0.027**，$$，##

圖2 妊娠期氣管內HCY-2的表達（10×10）

3 討論

HCY-2 是北京大學醫學部心血管研究所在高濃度的同型半胱氨酸誘導下從大鼠血管平滑肌細胞中克隆出的 4 個新的 cDNA 序列之一〔1〕。研究發現該基因與細胞凋亡密切相關，屬于凋亡基因〔6〕。HCY-2在成年大鼠的心臟、血管、肝、肺、腎臟、脊髓和腦組織中均表達〔3〕，并且在人體胚胎心臟發育的整個時期持續表達〔4〕，但是在胚胎發育時期除心臟外的其他臟器中是否表達以及是否具有作用還有待進一步探討。

在該研究中，HCY-2在人胚氣管和肺發育的整個過程中持續表達，并且其表達部位主要為氣管及各級支氣管的上皮和腺上皮。李英等〔3〕研究發現，HCY-2 在功能活躍或者增殖分裂能力強的細胞中高表達。而我們先前的研究結果也顯示，心肌細胞內HCY-2的表達與心肌細胞的增殖呈正相關，當在心肌細胞中HCY-2高表達時，心肌細胞的增殖率隨著HCY-2表達增高而升高，從而促進心肌細胞的生長和增殖；當HCY-2 低表達時，心肌細胞的生長率與HCY-2 的表達情況呈負相關〔5〕。在人胚氣管和肺等發育過程中，構成氣管和肺的主要細胞數量逐漸增多時，與之相對應的是HCY-2持續表達。因此可以推測在人胚呼吸系統發育過程中，HCY-2 的表達與組成呼吸系統的主要組成細胞的生長和增殖有關；HCY-2通過調節細胞的增殖來參與氣管和肺的發育。

在雞胚轉HCY-2 基因研究時發現，HCY-2 基因高表達與雞胚心室、心房發育、心臟結構紊亂、心內膜墊缺損以及心臟組成的主要細胞心肌細胞的超微結構改變密切相關〔7-9〕；在培養的人胚心肌細胞中的研究表明，HCY-2基因的表達改變可引起心肌細胞超微結構發生改變〔10〕。HCY-2 基因的異常表達可以引起雞胚包括異位心和心臟過小等的心血管系統發育異常，因此推測HCY-2是一種導致胚胎發育異常的毒性因子。在內皮細胞內轉染HCY-2基因，發現HCY-2 可以促進內皮細胞凋亡，而細胞凋亡在胚胎發育的整個過程中具有十分重要的作用〔11-12〕。因此進一步推測HCY-2 的表達蛋白通過引起細胞凋亡調節氣管和肺的發育。

陳光慧等〔6〕研究表明，HCY-2 是一個凋亡促進基因，可以促進心肌細胞發生凋亡。在我們前期的研究中，HCY-2在室間隔膜部缺損的人胚心臟中表達明顯高于正常發育的人胚心臟〔4〕，推測在心臟發育過程中HCY-2 基因通過調控細胞凋亡來影響心臟內部的分隔。基因數據庫比對研究發現HCY-2 基因與 RIP3 基因高度同源〔10〕，為 RIP3 的同源基因。RIP3基因通過激活caspase-2以引發一系列的級聯反應，從而導致細胞的凋亡〔13〕。在Hela 細胞中對RIP3進行基因沉默，第二信使cAMP和cGMP將不能夠被激活，從而使細胞的信號傳導途徑受阻，細胞失去正常的功能〔14-15〕。在人胚氣管和肺的發育中，HCY-2 的表達分別在近足月和妊娠早中期表達最高，而此時胚胎的氣管和肺的發育活躍，組織結構改變明顯，而在妊娠中期和近足月表達最低，這個時期胚胎的氣管和肺的發育相對平穩，因此HCY-2在人體胚胎氣管和肺的發育過程中，氣管和肺的正常結構形成方面具有重要的作用，但是其具體作用機制還有待進一步研究。首先需要獲得氣管和肺畸形的胚胎，以研究HCY-2 的表達改變；另外在動物水平通過分子生物學技術使HCY-2 基因表達缺失來研究氣管和肺的發育，這樣才能夠完全闡明HCY-2在胚胎氣管和肺的發育中的作用及其機制。

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