神經生長因子調控降鈣素基因相關肽的表達及對MG-63細胞增殖的影響

孫嵩 高強國 張綱 譚穎徽

第三軍醫大學新橋醫院口腔頜面外科，重慶 400037

頜骨的骨創傷愈合是一個連續的生理過程，包括血腫中細胞遷移，血管生成以及骨痂的改建等[1]，同時也包括在骨細胞增殖和分化過程中細胞因子的調控，骨誘導，分子信號傳導作用等，是一個多因素參與的修復過程。本課題組在前期研究[2]中發現，降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）在下頜骨缺損的愈合過程中起著重要的作用，如CGRP能通過調節成骨細胞中骨保護素（osteoprotegerin，OPG）和核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）mRNA的表達從而間接影響骨代謝等。CGRP可調節成骨細胞內皮型一氧化氮合酶的表達從而調節成骨細胞的增殖分化[3]。本課題組同樣發現，神經系統也可以調節骨創傷的愈合過程，如下齒槽神經損傷能影響骨痂生成和礦化成骨量[4]。神經生長因子（nerve growth factor，NGF）是最早發現的神經營養因子（neurotrophic factors，NTFs）家族成員，在神經系統的發育和修復進程中起到重要的作用，同時在骨折修復中也扮演著重要角色。NGF存在于骨形成細胞中，通過上調成骨細胞活性，引導神經長入骨痂來促進骨的愈合[5]。在神經系統與骨代謝的關系中，NGF能否影響CGRP等信號肽的釋放以及影響途徑還少有研究。本研究通過NGF刺激MG-63細胞檢測CGRP的表達狀況，探討NGF對骨修復過程中神經遞質CGRP的影響以及對MG-63增殖的作用，旨在加深對骨創傷愈合機制的認識，為治療頜骨骨創傷愈合提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

人骨肉瘤細胞MG-63細胞株（ATCC公司，美國）；NGF、NGF酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑（Peprotech公司，美國）；高糖DMEM培養基、優質小牛血清（Hyclone公司，美國），瓊脂糖（上海生物科技有限公司），Trizol RNA 提取液（寶生物工程大連有限公司）；實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-QPCR）試劑盒（Thermo公司，美國）。

本實驗采用第2代MG-63細胞，接種細胞密度為每孔2×105個，NGF質量濃度梯度為0、10、30、100 ng·mL-1，收集樣本時間分別為1、2、3、4 d。

1.2 ELISA法測定CGRP的表達

將MG-63細胞以每毫升2×105個細胞的密度接種于24孔板，每孔1 mL，每組設復孔2個，收集上清液時間分別為1、2、3、4 d，嚴格按照ELISA試劑盒說明操作，每組實驗重復3次，于酶標儀上測定A450值，建立標準曲線，分析并計算CGRP質量濃度。

1.3 RT-QPCR法測定CGRP mRNA的表達

用Trizol提取法提取MG-63細胞總RNA，經微量分光光度計和10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳確定A260/A280值為1.8～2.0，取1 g樣本按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟合成cDNA。RT-QPCR條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。將cDNA對倍稀釋3次后作為模板，在熒光定量聚合酶鏈反應儀上測定樣本的表達結果，所用引物由上海英俊公司合成。CGRP上游引物：5’-ATGCAGCACCATTCAGGTCTG-3’，CGRP下游引物：5’-CCAGCCGATGAGTCACACAG-3’。總反應體系為25 μL：SYBR Premix EX Taq（TaKaRa公司，日本）12.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補至25 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。反應結束儀器自動生成循環閾（cycle threshold，Ct）值，用各組mRNA與內參基因的Ct值的差值（ΔCt）表示各組mRNA的相對表達量。

1.4 加入NGF受體阻斷劑后MG-63細胞中CGRP mRNA的表達

將1 mL細胞液接種于16孔板中，細胞密度為每孔2×105個，加10 μL不同質量濃度NGF（0、10、30、100 ng·mL-1）作用1、2、3、4 d 后，加50 ng·mL-1NGF受體阻斷劑PD98059 200 μL培養24 h，用RTQPCR檢測MG-63細胞分泌CGRP mRNA的情況。

1.5 細胞計數（cell counting kit-8，CCK-8）法測定MG-63細胞增殖情況

NGF對MG-63細胞增殖的作用：將1 mL細胞液接種于16孔板中，細胞密度每孔2×105個，加入10 μL不同質量濃度NGF（0、10、30、100 ng·mL-1）培養1、2、3、4 d后棄上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL和90 μL PBS，振蕩混勻后繼續孵育2 h，測定450 nm波長下的吸光度值，每組實驗重復3次，以單獨MG-63細胞為空白對照。

NGF受體阻斷劑的作用：阻斷劑干擾組加入50 ng·mL-1的NGF受體阻斷劑200 μL培養24 h后棄上清液，每孔加入CCK-8溶液10 μL和90 μL PBS，振蕩混勻后繼續孵育2 h，測定450 nm波長下的吸光度值，每組實驗重復3次。

1.6 統計學分析

應用SPSS 10.0統計軟件采用t檢驗和單因素方差分析對數據進行分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 NGF刺激MG-63細胞中CGRP的表達

ELISA檢測發現，MG-63細胞自身可產生少量的CGRP，NGF可以明顯上調MG-63細胞CGRP的分泌（P<0.05），而且隨NGF質量濃度的升高，CGRP的濃度也相應升高（圖1）。此外，MG-63細胞上清液中CGRP的濃度隨不同質量濃度的NGF作用時間延長也相應增加（圖1）。

圖1 MG-63細胞中CGRP的表達Fig 1 The expression of CGRP in MG-63

2.2 NGF刺激MG-63細胞中CGRP mRNA的表達

RT-QPCR檢測發現，NGF可以明顯上調MG-63細胞CGRP mRNA的表達（P<0.05），而且隨NGF質量濃度的升高，此作用也相應增強（圖2）。此外，MG-63細胞總RNA中CGRP mRNA的表達量隨不同質量濃度NGF作用時間的延長也相應增加（P<0.05）（圖2），與ELISA檢測結果一致。

圖2 MG-63細胞中CGRP mRNA的表達Fig 2 The expression of CGRP mRNA in MG-63

2.3 加入NGF受體阻斷劑后MG-63細胞CGRP mRNA的表達

RT-QPCR檢測發現，加入NGF阻斷劑可以明顯降低MG-63細胞分泌的CGRP mRNA（P<0.05），隨NGF質量濃度升高，此作用也相應增強；第3天NGF阻斷劑的干擾作用最強（圖3）。

2.4 MG-63細胞增殖情況

CCK-8法檢測發現，加入NGF阻斷劑后MG-63的細胞增殖效率明顯低于其余組（P<0.05），而加入NGF刺激后MG-63細胞增殖效率明顯高于空白對照組（P<0.05），隨NGF質量濃度升高，此作用也相應增強（圖4）。實驗組NG-63細胞增殖效率隨NGF作用時間延長也相應增加（P<0.05）（圖4）。

圖3 加入NGF阻斷劑后MG-63細胞中CGRP mRNA的表達Fig 3 The expression of CGRP mRNA in MG-63 after added NGF receptor blocker

圖4 MG-63細胞的增殖效率Fig 4 The proliferation index of MG-63

3 討論

CGRP是感覺神經信號分子的重要一員，因在骨創傷愈合調控中具有重要作用而受到廣泛關注。CGRP、P物質、血管活性腸肽等一些神經肽類物質都有促進骨折修復重建的作用，而CGRP是在骨組織中分布最廣泛的一種感覺神經源性神經肽類物質，存在于口腔頜面部軟硬組織，在頜骨及其骨膜中均發現有大量CGRP陽性神經纖維分布[6]，在頜骨骨創傷修復重建過程中發揮著重要作用。

CGRP對成骨細胞具有重要的促增殖效應。研究[7]發現，CGRP可通過增強OPG mRNA的表達促進大鼠成骨細胞的增殖。Imai等[8]用基因重組培育出能分泌CGRP的轉基因大鼠，通過形態學觀察發現其成骨細胞活性大為增強，說明成骨細胞可以通過自分泌CGRP的方式促進自身和周圍細胞的增殖。但是，也有學者[9-10]通過檢測成骨細胞DNA的合成發現，CGRP對MG-63細胞的增殖有抑制作用。目前這一領域的主體認識是CGRP能夠通過上調成骨樣蛋白如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、Ⅰ型膠原蛋白（collegenⅠ）等成骨活性標志物的表達，促進成骨細胞分化成熟；但是同樣有學者報道CGRP對成骨細胞分化具有抑制作用。由此可見，該領域對CGRP和成骨細胞增殖和分化的作用機制的認識尚未完善，觀點存在矛盾。

NGF主要通過激活絲裂素活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號途徑而發揮其生物效應[11]，對神經系統生長發育有重要的作用。NGF在骨折愈合過程中也起到一定作用，在骨折愈合進程中可以檢測到NGF表達增加[12]。NGF在骨創傷愈合過程中不僅能促進下齒槽神經的再生，還能促進骨缺損愈合過程中的骨整合[13]。此外大量的體內和體外研究[14-15]也報道骨形成細胞中有NGF mRNA的表達。這表明骨創傷愈合過程中，NGF可以通過自分泌和旁分泌的形式參與。

在成骨細胞生物學研究中，采用與成骨細胞生物學行為高度類似的MG-63細胞株來代替成骨細胞進行研究已是常規方法。本研究通過預實驗發現，培養5 d后細胞株的活性下降明顯，因而采用1～4 d進行研究。在MG-63細胞株培養皿中加入NGF共培養，發現CGRP的表達量明顯增高，并且隨培養時間延長表達量也相應增加。RT-QPCR檢測發現，在相同觀測點的CGRP mRNA表達增加，與ELISA法檢測結果一致，從基因層面驗證了NGF對CGRP表達的上調作用。CCK-8法檢測到MG-63細胞的增殖效率也明顯增高。在MG-63細胞中加入NGF阻斷劑PD98059，CGRP表達量明顯減少，3 d時表達量最低，MG-63細胞的增殖效率也顯著降低。

綜上所述，NGF參與和影響骨創傷修復重建的方式可能是通過上調CGRP表達量從而間接調節骨創傷修復過程；然而NGF上調CGRP表達量的機制和途徑尚需進一步研究。

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