人牙齦干細胞的分離鑒定及基質細胞衍生因子-1對其趨化效應的研究

杜令倩 楊丕山 葛少華

1.山東大學第二醫院口腔科，濟南 250033；2.山東大學口腔醫院牙周病科 山東省口腔生物醫學重點實驗室，濟南 250012

牙周病治療的最終目標是重建因炎癥而破壞的牙周支持組織，關鍵是有足夠量的功能細胞遷移到組織缺損區域，發揮干細胞作用，引導牙周缺損組織的再生。然而，由于長期慢性炎癥的影響，病損區域功能細胞數量不足，功能不佳，如何獲得更多的再生性功能細胞是牙周病治療的關鍵。近年來，從牙齦組織中分離的牙齦干細胞（gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）受到了高度關注，無論是在體內環境還是在體外環境中，GMSCs都顯示出具有多向分化、自我更新和免疫調節的能力，并具有組織愈合能力強且無瘢痕愈合的特點[1-2]。此外，GMSCs還具有取材容易、來源豐富、抗炎和免疫調節功能。從病變牙齦組織中分離培養的GMSCs，其自我更新及多向分化能力與健康牙齦組織無明顯差異[3]，因此，牙周病治療過程中，募集病損周圍的GMSCs遷移到缺損區域，發揮干細胞作用以重建牙周組織為牙周組織再生提供新的思路。

趨化因子基質細胞衍生因子-1（stromal cellderived factor-1，SDF-1）即CXCL12，屬于趨化因子CXC家族，它通過激活G-蛋白偶聯的特異性受體CXCR4，調控細胞的分化、增殖，細胞遷移及細胞形態等活性[4-6]。SDF-1能夠募集骨髓基質干細胞歸巢，調控其增殖和分化，從而在組織和器官的再生中發揮重要作用。本課題組在前期研究[7]中證實，趨化因子具有募集包括牙周膜干細胞遷移到牙周創區從而促進牙周組織再生的能力。目前關于SDF-1對GMSCs的趨化效應卻知之甚少，本研究的目的是觀察趨化因子SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達及SDF-1對人GMSCs的趨化效應。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Hyclone公司，美國），Ⅰ型膠原酶、DispaseⅡ、胰蛋白酶（Gibco公司，美國），維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸、茜素紅、油紅O（Sigma公司，美國），SDF-1（Santa Cruz公司，美國），CXCR4抗體（R&D Systems公司，美國），抗CD44、抗CD73、抗CD90、抗CD105、 抗CD166、抗CD45、抗CD14、抗CD34抗體（BioLegend公司，美國），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）熒光標記二抗、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（北京中杉金橋生物科技有限公司）。各型號培養板、培養瓶、凍存管、離心管等（Corning公司，美國），70 μm細胞篩網（Falcon公司，美國）。GBB16 CO2紫外清潔型培養箱（Heraeus公司，德國），DL-CJ-IN型高性能超凈工作臺（哈爾濱市東聯電子技術公司），BP221S型電子分析天平（德國賽多利斯股份公司），OLYMPUS熒光顯微鏡和成像系統（Olympus公司，日本），流式細胞分析儀（Beckman Coulter公司，美國）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代細胞培養 標本的取得經山東大學醫學院醫學倫理委員會批準（審批編號為2010015），并獲取患者的知情同意，簽署知情同意書。標本取自臨床上需行牙冠延長術的6例牙周健康患者術中切除的牙齦組織，分別將牙齦組織剪碎后，移入6個離心管中，加入3 g·L-1的Ⅰ型膠原酶和4 g·L-1DispaseⅡ輕輕振蕩，37 ℃下消化2 h，通過細胞篩網獲得單個離散的細胞，將細胞密度調整為60個·cm-2，接種于含α-MEM培養基的培養皿中，培養基中含20% FBS、2 mmol·L-1L-谷氨酰胺、1 mmol·L-1丙酮酸鈉、50 U·mL-1青霉素、50 μg·mL-1鏈霉素和2.5 μg·mL-1兩性霉素B，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養，每隔3 d換液，待細胞鋪滿培養瓶底70%～80%后傳代。來自6個樣本的細胞分別進行以下實驗。

1.2.2 有限稀釋法分離人GMSCs 取對數生長期的細胞，消化成單細胞懸液，稀釋至每毫升10個細胞，接種于96孔板中，加液至每孔0.1 mL，培養24 h后，在顯微鏡下挑出只含單個細胞的孔并標記，每隔3 d換液。顯微鏡下觀察孔內細胞形成較大克隆并長至孔底1/3～1/2后，消化并擴大培養，此時獲得的細胞即GMSCs。

1.2.3 人GMSCs克隆形成能力分析 將GMSCs以每孔500個細胞的密度分別接種于六孔板中，培養液為含20%FBS的α-MEM，5%CO2、37 ℃飽和濕度條件下培養14 d，PBS沖洗2遍，4%多聚甲醛固定，甲苯胺藍染色，顯微鏡下觀察計數，多于50個細胞的集落記為1個克隆。克隆形成率（colony forming unitfibroblastic，CFU-F）計算公式如下：CFU-F=細胞克隆形成數/接種細胞數×100%。

1.2.4 人GMSCs表面抗原的檢測 將GMSCs制成單細胞懸液，調整細胞密度為1×105個·mL-1，分別與FITC標記的單克隆抗體CD44、CD73、CD90、CD105、CD166、CD14、CD34、CD45在冰上孵育1 h后，加入二抗（CD14、CD34、CD45不用二抗），冰上孵育30 min，1%多聚甲醛固定，4 ℃避光保存，用流式細胞儀分析相關抗原標志物的表達。

1.2.5 人GMSCs多向分化能力的檢測 分別用成骨誘導劑（0.1 μmol·L-1地塞米松，50 mg·L-1維生素C，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉）、成脂誘導劑（0.5 μmol·L-1地塞米松，60 μmol·L-1吲哚美辛，0.5 mmol·L-1異丁基甲基黃嘌呤，10 mg·L-1牛胰島素）誘導GMSCs向成骨和成脂方向分化，并分別用茜素紅鈣鹽染色法、油紅O染色法來測定GMSCs的多向分化能力。

1.2.6 免疫熒光法檢測SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達 將人GMSCs制成細胞爬片，進行免疫熒光染色。4%多聚甲醛室溫固定15 min，10%山羊血清37 ℃封閉30 min后滴加適量稀釋后的CXCR4抗體（1∶50），以PBS代替一抗作陰性對照，置于濕盒中4 ℃孵育過夜。次日在37 ℃下避光孵育l h后加入FITC熒光標記的二抗，避光孵育1 h，用5 μg·mL-1DAPI復染細胞核5 min，檢測趨化因子SDF-1受體CXCR4的表達。

1.2.7 SDF-1對人GMSCs的趨化效應 用多聚碳酸膜上有8 μm微孔的24孔Transwell細胞培養室檢測人GMSCs對SDF-1的趨化反應[7-8]。將第3代GMSCs調整至細胞密度為5×105個·mL-1，在細胞培養室的上腔分別加入200 μL細胞懸液（含0.01% FBS的α-MEM培養基），實驗組的下腔分別加入終質量濃度為100、200 ng·mL-1SDF-1和50 μg·mL-1CXCR4中和抗體的含0.01%FBS的α-MEM培養基500 μL。空白對照組下腔中加入含0.01%FBS的α-MEM培養基500 μL。為證實細胞的遷移效應是由于SDF-1的趨化效應而非細胞的化學運動，消除細胞培養室上下腔中SDF-1的濃度梯度，上下腔中所用培養液均含有100 ng·mL-1SDF-1。所有的樣本均設有復孔。37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養24 h后，用4%多聚甲醛固定濾膜上下表面附著的細胞30 min，用棉簽輕輕拭去濾膜上表面的細胞，PBS沖洗。伊紅染色濾膜3 min，PBS沖洗。待濾膜干燥后，計數已遷移至濾膜下側面的細胞，每個濾膜隨機觀察3個不重疊的高倍視野。

1.3 統計學處理

每組實驗重復4次，所得數據使用SPSS 13.0統計軟件包進行處理。計量資料統計結果以均數±標準差表示，多組樣本均數比較采用單因素方差分析，檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 形態學觀察

原代培養的人GMSCs呈集落樣生長（圖1A），有限稀釋法體外分離擴增獲得人GMSCs（圖1B），人GMSCs具有成纖維細胞的形態特征，細胞多呈長梭形，具有2～3個細胞突起，細胞核居中（圖1C）。

圖1 人GMSCs的分離培養 倒置相差顯微鏡Fig 1 Isolation and characterization of human GMSCs inverted phase contrast microscope

2.2 人GMSCs的CFU-F分析

GMSCs在體外呈集落樣增殖，形成克隆細胞簇（圖2），經計算，GMSCs的CFU-F為21.4%±2.8%。

2.3 人GMSCs表面標志物的表達

通過流式細胞儀檢測，人GMSCs表面標志物表達見圖3：GMSCs陽性表達間充質干細胞表面標志物CD44、CD73、CD90、CD105和 CD166（陽性率分別為99.40%、99.86%、99.95%、99.39%、99.89%），而造血干細胞表面標志物CD14、CD34和CD45表達為陰性（陽性率分別為0.57%、0.79%、0.80%）。

圖2 人GMSCs形成的單克隆集落 甲苯胺藍染色Fig 2 Human GMSCs cell clusters derived from a single colony toluidine blue

2.4 人GMSCs向成骨細胞及成脂細胞分化

經成骨誘導劑誘導4周后，茜素紅鈣鹽染色顯示紅色的礦化結節形成（圖4左），呈散在分布，周邊界限不清，周圍可見GMSCs，生長中心處礦化結節較多。經成脂誘導劑誘導4周后，油紅O染色顯示細胞內出現密集紅染的脂肪小滴（圖4右），GMSCs向脂肪細胞分化。

2.5 SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達

免疫熒光檢測的結果如圖5所示：人GMSCs上趨化因子SDF-1受體CXCR4呈陽性表達，細胞膜和細胞質發出紅色熒光，細胞核經DAPI染色后發出藍色熒光。

圖3 流式細胞儀檢測人GMSCs表面標志物表達Fig 3 The result of flowcytometry analysis of human GMSCs

圖4 人GMSCs向成骨細胞和成脂細胞分化情況× 40Fig 4 Osteogenic and adipogenic differentiation potentials of human GMSCs× 40

圖5 人GMSCs表達CXCR4，CXCR4發出紅色熒光，細胞核發出藍色熒光 免疫熒光染色× 400Fig 5 Expression of CXCR4 on human GMSCs,CXCR4 red fluorescent signals and nuclei blue signals immunohistochemical staining× 400

2.6 SDF-1對人GMSCs的趨化效應

在不同質量濃度的SDF-1作用下，人GMSCs對SDF-1顯示不同的趨化反應。SDF-1為100、200 ng·mL-1時，GMSCs遷移至膜下表面的每高倍視野細胞數目分別是189.3±4.4和164.6±4.9，細胞數目明顯多于空白對照組的47.8±2.5，差異有統計學意義（P<0.01）。經50 μg·mL-1CXCR4中和抗體處理后，與空白對照組相比，遷移的細胞數目明顯減少，每高倍視野細胞數從47.8±2.5減少到29.0±2.4，其差異有統計學意義（P<0.01），這提示SDF-1的促遷移效應是由CXCR4介導的。在消除細胞培養室上下腔中SDF-1濃度梯度后，遷移至膜下表面的每高倍視野細胞數目為51.3±3.0，明顯少于下腔中含100 ng·mL-1SDF-1實驗組的189.3±4.4（P<0.01），說明GMSCs細胞的遷移是由SDF-1引起的趨化效應而不是GMSCs的化學運動。

3 討論

牙周缺損組織的再生是牙周病治療的難點，近年來，以干細胞為基礎的再生性治療措施使牙周缺損修復取得了一定的進展。干細胞移植[9]及各種生長因子的應用[10]等方式可以通過增加牙周病損區域間充質干細胞的數量并促進其增殖分化以修復牙周缺損；但是干細胞介導的治療需要從患者健康組織處取材，進行大量的體外操作，而在體外培養中，間充質干細胞會喪失其原有表型，增殖、分化、遷移、歸巢等很多干細胞的特性逐漸喪失[11-12]，移植細胞的成瘤性、免疫排斥還無法解決，而且還存在倫理道德等方面的不利因素，因此，從牙周病損周圍組織及血管中募集更多的再生性細胞可能是牙周組織再生研究的一個更重要方向。

GMSCs一直以來被看作是牙周組織再生的不利因素，然而近年來的研究證實，從牙齦組織中分離的GMSCs具有自我更新能力并有多向分化潛能，比骨髓基質細胞具有更強的增殖能力且表型穩定，經長期的體外培養仍能保持正常的細胞核型和端粒酶活性[13]，這可能是造成牙齦組織愈合能力強且能夠無瘢痕愈合的原因之一。研究[14]表明，GMSCs在體內具有成骨能力，可以有效修復裸鼠下頜及顱骨缺損，提示GMSCs在牙周病的治療中具有廣闊的研究前景和開發空間。還有研究[3]發現，雖然牙周病變組織存在長期的慢性炎癥，但從病變牙齦組織中分離培養的GMSCs的自我更新及多向分化能力與健康牙齦組織無明顯差異。由此推測，將GMSCs應用于牙周組織再生具有可行性，并具有良好的臨床推廣價值，因此將GMSCs從牙周缺損周圍募集到缺損區可能促進炎癥組織早期愈合修復及再生。

本研究成功分離出人GMSCs，有較高的自我更新能力，并高表達間充質干細胞表面標志物CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，而造血干細胞標志物CD14、 CD34和CD45表達陰性。體外克隆形成實驗表明，GMSCs有較高的克隆形成能力。在體外誘導環境下，GMSCs具有向成骨細胞及成脂細胞分化的能力。

本實驗將趨化因子SDF-1引入GMSCs中。SDF-1和CXCR4是研究最多的一對趨化因子配體和受體，SDF-1能夠促進骨髓基質干細胞和其他前體細胞活化、生長和遷移。本研究檢測了趨化因子SDF-1受體CXCR4在人GMSCs上的表達，并研究了SDF-1對GMSCs遷移能力的影響，結果顯示，SDF-1對體外培養的人GMSCs具有趨化效應。趨化因子SDF-1受體CXCR4的表達得到證實，并且CXCR4的中和抗體能顯著降低SDF-1引起的遷移效應，進一步證實CXCR4為SDF-1的特異性受體，并提示這種趨化效應可能是通過其特異性受體CXCR4介導的。在本研究中，100 ng·mL-1的SDF-1促遷移效應要優于200 ng·mL-1，而對于牙周膜干細胞，SDF-1在200 ng·mL-1時促細胞遷移作用更佳[7]，原因可能與不同細胞表面SDF-1受體CXCR4的數目及表達水平存在差異有關。SDF-1/CXCR4信號通路在局部炎癥及牙周組織修復過程中扮演著雙重角色[15]。與健康對照組比較，牙周炎局部病損部位SDF-1與CXCR4表達水平升高，SDF-1募集GMSCs到病損區域的同時可能也募集了宿主防御細胞，在參與創傷愈合及組織修復的過程中也可能參與了宿主防御細胞的免疫監視。此外，前期實驗[7]結果表明，SDF-1通過其特異性受體CXCR4對人牙周膜干細胞有劑量依賴性的趨化效應，并且SDF-1能夠提高人牙周膜干細胞的細胞活性，促進其增殖并促進膠原形成。所有這些研究結果表明，有希望通過原位組織工程的方法，利用SDF-1募集牙周膜干細胞及GMSCs到達病損區域，通過促進這些細胞的活性、增殖及分化以修復牙周缺損；這些設想尚需進一步的體內實驗去證實。

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