白細胞介素-21和核因子κB受體活化因子配體在人根尖囊腫和肉芽腫中的表達及臨床意義

胡菊花 李倩 王艷青 李頌

安徽醫科大學口腔醫學院·附屬口腔醫院，安徽省口腔疾病研究中心實驗室，合肥 230032

慢性根尖周炎主要由感染根管內的細菌感染引起，以根尖部炎癥及牙槽骨破壞為特征；這是局部免疫反應的結果，這一免疫反應由炎癥細胞及其產物介導[1]。研究[2-5]證實，多種炎癥細胞存在于根尖周炎病損組織中，而淋巴細胞則是最主要的炎癥細胞；淋巴細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL）-17、干擾素γ、腫瘤壞死因子α、破骨細胞核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB ligand，RANKL）等已被證實參與根尖周炎的發病機制。

IL-21是近年來備受關注的淋巴細胞因子，主要由CD4+T淋巴細胞分泌，屬于IL-2家族。IL-21參與多種疾病的發病，例如類風濕性關節炎[6]和炎性腸病等[7]。有研究[8-10]顯示，IL-21也參與口腔疾病的發生。慢性牙周炎患者齦溝液及炎癥牙齦組織中IL-21的水平明顯高于正常人群[8]；牙周炎非手術治療后，IL-21的表達水平顯著下降[9]。這些研究結果表明IL-21可以促進牙周炎的病變進展。與牙周炎相似，根尖周炎也是細菌感染性疾病，其特征也是炎癥與骨破壞；但是關于IL-21與人慢性根尖周病的關系尚罕見報道。本研究旨在檢測IL-21在人慢性根尖周炎中的表達情況，并探討與骨破壞大小和叩痛的關系，探討IL-21在根尖周炎發病機制中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Olympus CX21FS1型光學顯微鏡（Olympus公司，日本），Spot Advanced顯微攝像系統（Diagnostic Instrument公司，美國），Image-Pro-Plus 6.0圖像處理系統（Media Cybemetics公司，美國），隔水式恒溫培養箱（GNP-9160型，上海三發科學儀器有限公司），E200型Nikon生物顯微鏡（Nikon公司，日本），RMZ125型LEICA組織切片機（Leica公司，德國），FYL-YS-128型福意聯低溫冰柜（北京福意電器有限公司），SY1-SZ-93型自動雙重純水蒸餾器（上海羽通儀器儀表廠），微波爐（廣東康寶電器有限公司），微型高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）。

1.2 樣本采集

收集安徽省口腔醫院口腔頜面外科2014年1—6月經根尖外科手術或拔牙所獲得的23例根尖囊腫和32例根尖肉芽腫作為實驗組，同時取10例未萌出第三磨牙的健康牙齦組織作為對照[11]。根尖肉芽腫的病理診斷標準：根尖部組織形成增生的肉芽組織團塊，周圍有纖維結締組織包繞，以炎癥細胞和成纖維細胞為主。根尖囊腫的病理診斷標準：以各種厚度的纖維囊腔為診斷特征，纖維囊腔被覆復層鱗狀上皮，厚薄不一，上皮釘突因炎癥刺激發生不規則增生、伸長，相互融合成網狀，上皮表現明顯的細胞間水腫和以中性粒細胞為主的上皮內炎癥細胞浸潤；纖維組織囊壁內炎癥明顯，炎癥浸潤細胞主要為淋巴細胞、漿細胞，混雜有中性粒細胞以及泡沫吞噬細胞[12]。

記錄樣本宿主的年齡、性別、牙位。患者納入標準：無其他口腔疾病和全身系統性疾病，過去1個月內未服用抗生素或非甾體類抗炎藥物。在進行臨床試驗之前，所有患者簽署知情同意書。本項研究獲得了安徽醫科大學生物醫學倫理委員會的倫理審查批準（批準號：2014013）。

1.3 臨床檢查

在進行根尖外科手術或拔牙之前，對患者進行口腔一般檢查及影像學檢查（錐形束CT）并記錄在冊。根據記錄資料獲取患者有無叩痛及其根尖病灶大小。采用雙盲法確定病灶大小，即由不知曉實驗目的的兩名醫師對錐形束CT圖像進行分析，取根尖低密度影像直徑的平均值進行資料分析。

1.4 免疫組織化學染色

切取5 μm厚的經石蠟包埋的組織切片用于免疫組織化學研究，所用方法為鏈霉親和素-生物素復合物（streptavidin-peroxidase，SP）法。使用兔抗人IL-21（編號ab154767，Abcam公司，美國）、山羊抗人RANKL（編號sc-7628，Santa Cruz Biotechnology公司，美國）的多克隆抗體作為一抗，兩種抗體所用稀釋倍數分別為1∶200和1∶150，整個實驗過程參照SP試劑盒（福建邁新生物技術有限公司）說明書進行。具體步驟如下：組織切片經常規脫蠟、脫水后進行抗原修復，滴加3%過氧化氫以阻斷內源性過氧化物酶的活性，PBS沖洗后滴加正常非免疫動物血清于室溫下孵化10 min，除去血清，滴加一抗于4 ℃冰箱中孵化過夜；然后滴加生物素標記的二抗，即羊抗兔/鼠IgG（KIT-9710）和兔抗羊IgG（KIT-9709）（福建邁新生物技術有限公司），37 ℃下孵育30 min，沖洗，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液孵育30 min，二氨基聯苯胺（3,3-diaminobenzidine，DAB）（武漢博士德生物工程有限公司）顯色，蘇木素復染，封片。陰性對照組：用PBS代替一抗孵育切片作為陰性對照。

1.5 陽性結果判定

在光學顯微鏡低倍鏡下觀察整張切片，每張切片隨機選取5個高倍視野（放大400倍）觀測IL-21和RANKL的表達并拍攝圖片。若觀察到細胞質及核膜上有棕色或褐色顆粒為陽性染色（即陽性表達）。采用Image-Pro-plus 6.0圖像處理系統計量每個組織切片上IL-21和RANKL的蛋白積分光密度（integrated optical density，IOD）值，采用Excel軟件錄入數據以備進行數據分析。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0和Excel軟件進行分析。對計量資料先進行兩組獨立樣本齊性檢驗，若方差齊采用t檢驗；利用卡方檢驗來評估IL-21表達率與叩痛有無相關性；用Spearman相關檢驗來評估IL-21與病灶大小及RANKL的相關性。檢驗水準為雙側α=0.05。

2 結果

2.1 患者的一般資料

患者資料及樣本信息如表1所示：根尖囊腫患者23例，年齡18～60歲，平均（43.5±12.7）歲；根尖肉芽腫32例，年齡20～65歲，平均（45.3±15.1）歲。2組患者的基本情況無明顯差異（P>0.05）。

表1 2組樣本的基本資料Tab 1 Demographic data of the two groups of subjects

2.2 免疫組織化學染色結果

免疫組織化學染色結果見圖1、2，所有病損組織中均檢測到IL-21、RANKL陽性表達，而正常牙齦組織和陰性對照組中均未見陽性表達。

圖1 IL-21在根尖肉芽腫和根尖囊腫中均有陽性表達，而在陰性對照組和牙齦組織中無陽性表達 DABFig 1 Presence of IL-21-positive cells in periapical granulomas and radicular cysts,and no expression in negative group and healthy gingival tissues DAB

圖2 RANKL在根尖肉芽腫和根尖囊腫中均有陽性表達，而在陰性對照組和牙齦組織中無陽性表達 DABFig 2 Presence of RANKL-positive cells in periapical granulomas and radicular c ysts,and no expression in negative group and healthy gingival tissues DAB

根尖囊腫和根尖肉芽腫兩組間IL-21和RANKL的表達強度及比較見表2，2組間IL-21和RANKL表達強度的差異均有統計學意義（P<0.05），在根尖囊腫中的表達強度高于根尖肉芽腫。

2.3 IL-21與RANKL表達、根尖病損大小和叩痛的相關關系

本研究分析了IL-21與RANKL表達、根尖病損大小和叩痛的相關關系，結果見表3。在根尖囊腫組，8例（34.78%）患者有叩痛表現，囊腫病損平均大小為7.8 mm；而在根尖肉芽腫組，13例（40.62%）患者有叩痛表現，病灶平均大小為2.9 mm。經卡方檢驗，IL-21的表達水平與叩痛無關（P>0.05）。

表2 根尖囊腫組、根尖肉芽腫組及健康牙齦組間IL-21和RANKL的表達及比較Tab 2 Expression and comparison of IL-21 and RANKL among cyst group,granuloma group and healthy gingival tissues

Spearman相關性檢驗顯示，在根尖囊腫和肉芽腫中，IL-21的表達水平與RANKL的表達水平均具有明顯的相關性（r值分別為0.935和0.958，P<0.05），IL-21的表達水平與病損大小也有明顯的相關性（r值分別為0.828和0.831，P<0.05）（表3）。

表3 根尖囊腫及根尖肉芽腫中IL-21的蛋白表達與RANKL及根尖病損大小的相關關系Tab 3 The correlation among the protein expression of IL-21 and RANKL,lesions size in cyst group and granuloma group

3 討論

眾所周知，根尖周病是根尖組織對抗細菌感染的反應結果，包括根尖炎癥和牙槽骨的破壞。這些病損以持續性的炎癥細胞遷徙及浸潤為特征，例如中性粒細胞、淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞和肥大細胞等。在這些細胞中，研究者們高度強調了T淋巴細胞的作用[13-15]。IL-21是一種主要由CD4+T細胞分泌的促炎癥細胞因子，可以上調炎癥細胞因子[6,10]及破骨細胞分化因子[16]的表達。基于這些研究結果，筆者猜測IL-21可能是參與根尖周炎發病機制的炎癥細胞因子之一，并且可能誘導RANKL蛋白表達參與根尖部骨質吸收作用。

本研究發現，IL-21陽性細胞存在于所有根尖周病損組織中，主要由T淋巴細胞樣細胞表達，但正常牙齦組織并無IL-21的表達，這說明IL-21可能參與根尖炎癥過程。Hatori等[11]在研究肝素結合生長因子在慢性根尖周炎中的表達及作用中，同樣采用健康牙齦組織作為陰性對照組，結果發現，IL-21在健康牙齦組織中無表達。此外，根尖囊腫組中IL-21的表達水平明顯高于肉芽腫組。Teixeira-Salum等[3]和de Carvalho Fraga等[15]研究顯示，根尖囊腫中促炎癥細胞因子如腫瘤壞死因子α、干擾素γ等表達量明顯高于根尖肉芽腫，而根尖肉芽腫中轉化生長因子的表達量高于根尖囊腫，說明根尖囊腫炎癥狀態高于肉芽腫。這些研究結果可以解釋本研究中IL-21作為促炎癥細胞因子在囊腫中的表達水平高于肉芽腫的原因。同樣，病變組織中RANKL的表達亦明顯高于對照組，這一結果與Fan等[17]的研究相一致；RANKL在囊腫中的表達強度明顯高于肉芽腫，與張梅華等[18]的研究結果相同。該結果提示，RANKL的表達隨病變發展而增加，可能是因為根尖囊腫病變活動期骨吸收活躍的緣故。

對IL-21和RANKL兩細胞因子的表達進行相關性分析，結果發現，在根尖囊腫組及肉芽腫組兩個細胞因子的表達均呈明顯正相關關系（r值分別為0.935和0.958），這與Kwok等[16]的研究結果相似。Kwok等[16]提取類風濕性關節炎患者的CD4+T細胞以及成纖維細胞樣滑膜細胞，并將IL-21加入細胞培養液中進行觀察，結果發現，隨著IL-21劑量的增加，RANKL mRNA的表達量增加，破骨細胞標記物即抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）也隨之增加。這些發現提示了IL-21可能通過促進RANKL的表達參與根尖周病的骨破壞過程。

本研究還發現，病灶大小和IL-21表達強度之間存在明顯的相關性（P<0.05）。Jang等[19]發現，敲除小鼠IL-21受體基因，阻斷IL-21/IL-21受體信號通路，其RANKL的表達量明顯減少。RANKL是重要的破骨細胞分化因子，參與根尖骨質破壞[5]，RANKL的表達減少使得骨質破壞和病損范圍隨之縮小。這可以解釋本研究中病灶大小與IL-21表達量呈正相關的原因。但是，本研究發現，IL-21的表達與叩痛無相關關系。這與Dutzan等[10]在牙周炎中的研究結果不同，他們發現IL-21與臨床癥狀如探診深度及附著喪失、探診出血具有強相關性。這種差異的原因目前尚不清楚，還需進一步研究。

總之，本研究證明IL-21存在于人慢性根尖周疾病中，且IL-21與RANKL及病灶大小具有正相關關系，參與根尖周炎的炎癥及骨吸收過程，該結果有助于進一步理解根尖周病的發病機制和病變的發展；但還需進一步研究以確定IL-21在慢性根尖周炎發病機制中的具體作用。

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