白細胞介素-23通過無翅基因相關整合位點/β-連環蛋白通路增強舌鱗狀細胞癌抗凋亡及耐藥能力

嚴嵚 蘇玉婷 周月鵬 朱海濤 楊細虎 許建輝

1.江蘇大學附屬醫院口腔科；2.放療科；3.腫瘤實驗室；4.影像科，鎮江 212000

口腔癌約占全身惡性腫瘤的3%[1]，其中超過90%為鱗狀細胞癌[2]。舌鱗狀細胞癌作為最常見的口腔癌之一，約占我國口腔癌發病總數的40%。研究數據顯示，我國口腔癌的發病對象正呈現出年輕化和女性化的趨勢，發病率也在逐年上升，而由于腫瘤細胞異常的抑制凋亡能力，包括化療在內的傳統治療手段對于控制其復發率和死亡率還存在明顯不足[3-5]。目前研究[6-11]表明，B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）癌基因家族形成了細胞中主要的抑制凋亡蛋白，并在凋亡發生的效應期發揮調控的作用；三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）及P-糖蛋白（permeability-glycoprotein，P-gp）為代表的跨膜蛋白可直接與藥物結合，充當廣泛的藥泵角色，主動參與到對化療藥物的拮抗過程中，而這些能力獲得與無翅基因相關整合位點（Wingless-related integration site，Wnt）通路活化程度有著密切聯系。近年來，免疫細胞及相關細胞因子對于腫瘤的調節作用逐漸成為了研究熱點之一，白細胞介素-23（interleukin-23，IL-23）參與到多種腫瘤的增殖及轉移過程中[12-16]。本研究旨在探討IL-23的浸潤表達程度與口腔癌惡性進程之間的聯系，并進一步研究其對化療抵抗能力形成的作用機制，為臨床治療提供理論及研究依據。

1 材料和方法

1.1 細胞、組織標本

舌鱗癌細胞株SCC9來源于美國模式培養物保藏所，由南京醫科大學腫瘤研究中心惠贈，培養于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基。收集2008年4月—2013年10月間江蘇大學附屬醫院口腔科的舌癌患者組織標本28例。其中，男性15例，女性13例，年齡41～81歲，平均年齡60.43歲。組織學分級為Ⅰ級25例，Ⅱ級1例，Ⅲ級2例。所有標本經術后病理診斷證實為舌鱗狀細胞癌。術后隨訪時間為11～77個月。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/F12培養液和胎牛血清（Gibco公司，美國），TRIzol試劑（Invitrogen公司，美國），Prime-Script?RT reagent Kit（Perfect Real Time）和SYBR?Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus，Takara公司，日本），順鉑（cisplatin，DDP）（南京制藥廠有限公司），重組人IL-23（R&D Systems公司，美國），Bcl-2、ABCG2、P-gp和β-連環蛋白（β-catenin）抗體（Cell Signaling Technology公司，美國），β-actin抗體和HRP標記的二抗（Santa Cruz公司，美國），Pierce ECL plus Substrate（Thermo Scientific公司，美國）。BB 15型CO2細胞培養箱（Heraeus公司，德國），5418R型臺式高速冷凍離心機（Eppendof公司，德國），BioMate 3s型核酸測定儀（Thermo Scientific公司，美國），My Cycler型聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）儀（BioRad公司，美國），Mx3000p型Real Time PCR擴增儀（Stratagene公司，美國）。

1.3 EnVision法進行免疫組織化學染色

石蠟切片，常規脫蠟、抗原修復、去內源性過氧化物酶以及血清封閉，一抗（IL-23，稀釋度1︰100）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育40 min，DAB顯色，蘇木精復染。乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察。每例標本在顯微鏡下隨機選擇10個高倍鏡視野（×400）。IL-23在標本中的表達強度評分標準如下。1）僅胞質為深棕色，呈強陽性，單視野中表達范圍超過70%，記為3分；2）胞質為棕色，呈陽性，表達范圍超過50%，記為2分；3）胞質為淺黃色，呈弱陽性，陽性區域占20%～50%，記為1分；4）胞質不著色為陰性或其他情況均不記分。PBS代替一抗而其他處理相同的標本作陰性對照組。

1.4 總RNA提取及逆轉錄

將105個處于對數生長期的SCC9細胞置于培養皿中，待12 h細胞貼壁后，分別加入濃度為10、50、100 ng·mL-1的IL-23，細胞培養箱中培養24 h后，根據TRIzol試劑說明書提取總RNA。核酸測定儀檢測各樣本RNA的A260/280為1.80～2.00。根據Prime-Script?RT reagent Kit產品說明書將各樣本的總RNA進行反轉錄，取10 μL反應體系，反應條件：37 ℃，15 min（反轉錄反應）；85 ℃，5 s（反轉錄酶的失活反應）。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測SCC9細胞株中Wnt1和c-myc的mRNA表達

所有引物均由Invitrogen公司合成。Wnt1基因上游引物序列：5’-ATGGGGCTCTGGGCGCTGTTG-3’，下游引物序列：5’-CACACGTGCAGGATTCGATGG-3’；c-myc基因上游引物序列：5’-CTCTCAACGACAGCAGCCCG-3’，下游引物序列：5’-AGGTGATCCAGACTCTGACC-3’；內參GAPDH基因上游引物序列：5’-TCAACGGATTTGGTCGTATTG-3’，下游引物序列：5’-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’。PCR反應體系25 μL，其中2×SYBR?Premix Ex TaqTM12.5 μL、10 μmol·L-1上游引物和下游引物各0.5 μL，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，cDNA模版2 μL，ddH2O 9 μL。以上所有反應過程均在冰上進行。反應條件為：95 ℃，30 s預變性；95 ℃，5 s變性，60 ℃，20 s退火/延伸，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。

1.6 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測IL-23對順鉑殺傷的拮抗作用

取對數生長期的SCC9細胞消化后制成單細胞懸液，并調整細胞密度為每毫升5×103個，接種于96孔板中，每孔培養液200 μL，待細胞貼壁分為10、50、100 ng·mL-1的IL-23預處理組與正常培養基組，24 h后IL-23預處理組將培養基換為：正常培養基或者含有2 μg·mL-1順鉑的培養基；正常培養基組將培養基換為：正常培養基或者含有2 μg·mL-1順鉑的培養基；每組設6個復孔。24 h或者48 h后，每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，孵育4 h，棄去液體，每孔加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，振蕩10 min后，在570 nm波長下檢測每孔的吸光度（optical density，OD），每相同設計組重復3次。設DMSO為調零孔，空白對照孔只加正常培養液。按下列公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率=（1?實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

1.7 Western blot檢測Bcl-2、P-gp、β-catenin、ABCG2蛋白的表達

將處于對數生長期的SCC9細胞株分為β-cateninsiRNA預處理組和未處理組。沉默β-catenin的靶向小分子干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）正義序列：5’-GUCCUGUAUGAGUGGGAACTTdTdT-3’；反義序列：5’-GUUCCCACUCAUACAGGACTTdTdT-3’。24 h后分別換用含10 ng·mL-1IL-23培養基處理或正常培養基處理。繼續培養24 h后提取總蛋白，分光光度計Biomate 3s測定蛋白濃度，煮沸變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉1 h，一抗（Bcl-2、P-gp、β-catenin、ABCG2，稀釋度1︰1 000）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次40 min。二抗（HRP標記的IgG，稀釋度1︰5 000）室溫孵育1 h，洗膜3次后電化學發光（electrochemiluminescence，ECL）顯影。

1.8 統計分析

采用SPSS 19.0軟件分析數據資料，PCR結果使用非參數檢驗進行統計分析，P<0.05為有統計學意義；Western blot結果使用Alpha View軟件進行分析。

2 結果

2.1 IL-23在舌鱗狀細胞癌組織中的表達

免疫組織化學檢測結果顯示，IL-23在原位舌癌組織或者發生轉移的癌組織及癌旁的正常組織中均有表達，但表達強度、范圍及分布存在明顯差異。具體表現為轉移癌組織中IL-23的表達區域多超過70%，呈深棕色；原位癌組織中陽性區域低于40%，且棕色、黃色居多；癌旁組織分布散在，陽性區域普遍淡染（圖1）。結合28例舌鱗癌患者的腫瘤特征及臨床預后，統計后發現癌組織中IL-23的表達與腫瘤淋巴結轉移（P<0.05）、神經侵犯（P<0.01）和治療復發（P<0.05）相關，與其他因素相比較差異無統計學意義（表1）。

圖1 28例舌鱗狀細胞癌患者組織中IL-23的表達 免疫組織化學染色× 200Fig 1 IL-23 expression in 28 cases of tongue squamous cell carcinoma tissue from patients immunohistochemistry× 200

2.2 IL-23對Wnt通路轉錄起始的影響

經IL-23刺激后的舌鱗狀細胞癌細胞株SCC9中Wnt1的表達明顯上調（P<0.01）；同時，c-myc的轉錄水平也顯著增強（P<0.01），0～10 ng·mL-1的IL-23范圍內Wnt1和c-myc的上調具有濃度依賴性，并且在10～100 ng·mL-1的濃度范圍內兩者的表達均能維持較高水平，即IL-23可以顯著增強Wnt通路活化（圖2）。

表1 IL-23的相對表達水平與舌鱗狀細胞癌患者臨床及病理學特征的相關性Tab 1 The correlation of the relative expression levels of IL-23 and clinical-pathological features of tongue squamous cell carcinoma patients

圖2 qRT-PCR檢測IL-23處理后Wnt1及c-myc的mRNA表達水平Fig 2 The detection of mRNA level of Wnt1 and c-myc dealed with IL-23 by qRT-PCR

2.3 IL-23對SCC9細胞抗凋亡能力的影響及作用機制

Western blot法檢測濃度為10 ng·mL-1的IL-23預處理24 h后SCC9細胞相關蛋白表達的變化，結果顯示β-catenin、Bcl-2、P-gp、ABCG2均明顯上調（圖3上）。只作siRNA處理后，β-catenin明顯下降，協同Bcl-2、P-gp與ABCG2相對表達水平均明顯降低（P<0.01）；沉默β-catenin后，IL-23處理下Bcl-2、P-gp和ABCG2與對照組相比無明顯變化（P>0.05）（圖3下）。

2.4 順鉑檢測IL-23的抗凋亡能力

IL-23可促進SCC9細胞的增殖（P<0.01）；IL-23預處理24 h后，順鉑處理組細胞表現出明顯的抵抗作用（P<0.01）；48 h后抵抗能力有所下降（圖4）。

圖3 IL-23處理對抗凋亡相關蛋白表達的影響Fig 3 The effect of anti-apoptosis related proteins dealed with IL-23

圖4 MTT檢測IL-23處理前后SCC9細胞株的相對細胞活性Fig 4 Relative cell viability of SCC9 cells before and after dealing with IL-23 by MTT

3 討論

近年來，越來越多的研究[17-18]表明IL-23作為促炎性細胞因子，其表達失衡紊亂不僅能引發類風濕關節炎、牛皮癬、系統性紅斑狼瘡等多種自身免疫系統疾病，而且還能夠促進腫瘤細胞的遷移和侵襲：如在肝癌發現IL-23可以通過上調基質金屬蛋白酶9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）表達促進轉移[13]；IL-23與肺癌細胞上受體結合后可促進增殖[14]；而乳腺癌患者外周循環中的IL-23表達強度與預后有關[15]；IL-23還可以促進轉錄因子Rel-A進核后增強口腔鱗癌細胞的增殖等[16]。本文通過對舌鱗狀細胞癌患者病理組織與腫瘤進程的綜合研究發現，IL-23異常表達與腫瘤患者的淋巴結轉移、神經侵犯和治療復發密切相關，其高表達常伴隨著腫瘤復發和轉移行為的發生，所以在隨后的體外實驗中對IL-23在舌鱗狀細胞癌細胞惡性能力獲得的具體調節作用作了進一步探討。

目前，化療是控制惡性腫瘤轉移和復發的主要治療手段之一。相對正常組織細胞，腫瘤細胞中普遍存在的耐藥以及抗凋亡能力直接影響著臨床治療的效果及預后。治療拮抗形成機制復雜，需要多重因素構成的內外環境共同調控，現有研究已經表明免疫細胞及其調節因子參與構成了腫瘤微環境，但其中IL-23在舌鱗狀細胞癌細胞耐藥能力獲得中所起作用的研究還未見報道。作為調控耐藥、抗凋亡、增殖、侵襲與轉移的重要節點，Wnt/β-catenin通路在腫瘤細胞多種惡性行為形成中具有關鍵作用，其中β-catenin可直接進入細胞核中充當轉錄調控因子。具體表現為Wnt蛋白與Frizzled家族跨膜受體蛋白結合后，抑制糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/軸蛋白（Axin）/大腸腺瘤息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）復合體繼續對β-catenin的泛素化降解，使得β-catenin得以與T細胞因子/淋巴增強因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）結合，引起下游諸如cmyc、Bcl、ABCG、P-gp等表達上調[10-11,19]。其中，c-myc基因表達通常被認為是Wnt通路激活的標志[19]；而作為抗凋亡蛋白中代表性一員，Bcl-2能夠顯著增強腫瘤細胞對大多數DNA損傷因子的抵抗性，抑制化療藥物引起的細胞凋亡或者直接阻止激活凋亡的信號下游轉導[5]；ABCG2和P-gp作為跨膜糖蛋白藥泵，通過降低腫瘤細胞內藥物濃度發揮拮抗化療的作用，兩者的異常上調直接影響腫瘤細胞化療引起的抗凋亡能力的獲得[6-9]。為了驗證IL-23作用途徑，首先在miRNA水平上證實了Wnt1及c-myc的表達上升與IL-23的作用濃度密切相關；在進一步證實IL-23刺激作用依賴于Wnt活化程度的相關實驗中，結合siRNA技術沉默Wnt通路中關鍵信號蛋白β-catenin的表達后發現：預處理siRNA可降低IL-23促進β-catenin表達及對Wnt下游Bcl-2、ABCG2、P-gp表達上調作用。由此，推測IL-23對舌鱗狀細胞癌細胞的抗凋亡能力的影響是通過顯著加強了SCC9細胞的Wnt1表達，促使其分泌后作用于自身或者相鄰細胞，活化Wnt通路造成胞漿內β-catenin進入到細胞核，結合核內轉錄因子并調節下游c-myc、抗凋亡及耐藥蛋白的表達。為了模擬并驗證化療藥物處理下，IL-23對舌癌細胞的影響，選擇了常用化療藥物順鉑，其通過抑制腫瘤細胞內RNA以及蛋白質合成發揮廣譜殺傷作用。實驗結果進一步顯示，IL-23預處理后舌鱗狀細胞癌細胞抗凋亡能力得到加強，順鉑對其增殖無明顯抑制。證實了IL-23刺激下可以削弱化療藥物對舌鱗狀細胞癌細胞的毒性作用。

綜合以上結果，本研究發現IL-23不僅參與到腫瘤組織的浸潤、侵襲及復發中，而且在體外實驗還首次證實了其具有增強腫瘤細胞抗凋亡及耐藥能力的作用。IL-23作為主要由巨噬細胞及樹突狀細胞分泌的細胞因子，卻在腫瘤的惡性行為形成中扮演著重要角色，這一現象的揭示，為深入研究免疫調節在腫瘤發展中的作用提供了有力的依據，對惡性腫瘤綜合治療方案的制定也具有重要的指導意義。

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