4種納米羥磷灰石復合材料對糞腸球菌抗菌性能的初步研究

劉奕 周榮靜 吳紅崑

1.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，成都 610072；2.聊城市人民醫院口腔科，聊城 252000；3.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫院特需門診（四川大學），成都 610041

牙髓根尖周病是最常見的口腔疾病，嚴重影響人類的口腔和全身健康。根管治療術是目前治療牙髓根尖周病最有效的方法，但臨床研究顯示，即使經過完善的根管治療，患牙仍存在4%～15%的失敗率[1]，而進行根管再處理的成功率僅為66%～74%[2]。糞腸球菌以生物膜的形式定植于根管系統[3]，是導致根管治療再感染的主要微生物之一，是目前評價根管治療過程中各種感染清除措施有效性最常采用的目標菌種。研究[4-5]發現，臨床常用的根管消毒劑氫氧化鈣在體內外環境中對糞腸球菌無明顯抑制作用。目前臨床上尚未找到一種對糞腸球菌安全有效的根管消毒藥物。

納米羥磷灰石復合材料作為一種新型無機材料，安全無毒，生物相容性好，廣泛用于醫療各領域。銀、釔、鈰等金屬離子的加入，更賦予材料一定的抑菌性能。目前，納米復合抗菌材料多應用于種植體表面涂層、骨修復、充填修復等領域，也有部分學者曾研究這類材料的防齲功能，但對其在根管治療領域的應用研究還比較少見。特別是對難治性牙髓根尖周病變中的常見菌——糞腸球菌影響的研究還罕見報道。本課題通過比較4種納米羥磷灰石復合材料對糞腸球菌的影響，擬篩選一種對糞腸球菌有高效抑制作用的根管消毒藥物，為無機納米材料在根管治療領域的應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

載銀納米羥磷灰石水溶膠（Ag/nHA）、載釔納米羥磷灰石水溶膠（Yi/nHA）、載鈰納米羥磷灰石水溶膠（Ce/nHA）、納米羥磷灰石水溶膠（nHA）（四川大學納米生物材料研究中心）；糞腸球菌（ATCC29212）由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。

光學顯微鏡（Nikon公司，日本），隔水式電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠），高速離心機（上海安亭科學儀器廠），ProtoCOL SR全自動抑菌環測量儀（Synbiosis公司，英國），Microstation全自動微生物鑒定儀（Biolog公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料溶液的配制 采用透射電鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察各組復合納米微晶的形貌和尺寸，納米微晶晶化好，形貌均為納米級針狀微晶。分別取復合納米羥磷灰石水溶膠（Ag/nHA、Yi/nHA、Ce/nHA、nHA）3 000 r·min-1離心2 min，去上清液。無菌去離子水超聲振蕩下分散，配制成濃度為320 g·L-1的納米微晶溶膠貯存液備用。

1.2.2 糞腸球菌菌懸液的配制 取糞腸球菌的牛奶保存液50 μL，接種于普通瓊脂（BA）固體培養基上，恒溫培養箱37 ℃培養24 h進行細菌復蘇。挑取部分菌落革蘭染色后，光學顯微鏡下觀察菌落的形態，鏡檢無污染，涂片檢查證實為純培養后進行傳代培養，備用。

無菌接種環挑取經鑒定的純培養單個糞腸球菌菌落置于含2 mL BA液體培養基的康氏管中進行24 h增菌，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制成濃度為1×107、1×104、1×103CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液備用。

1.2.3 瓊脂擴散實驗 用微量加樣槍吸取濃度為1×107CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液50 μL，滴加于直徑為90 mm的BA瓊脂平皿上，無菌玻棒涂抹均勻。每個平皿平均劃分5個加樣區，加樣區分別加20 μL濃度為320 g·L-1的實驗材料溶膠，生理鹽水濾紙片為空白對照。室溫放置1 h后，100%濕度、37 ℃有氧條件下，恒溫培養箱內培養24 h。ProtoCOL SR全自動抑菌環測量儀測量不同實驗材料對糞腸球菌的抑菌環直徑大小。每種實驗材料均設置5個平行對照組，分別記錄20 μL實驗材料溶膠在BA平皿上的直徑、抑菌環的直徑，并且觀測不同實驗材料的抑菌環范圍。

1.2.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定 含實驗材料瓊脂平皿的配制：采用對倍系列稀釋法，用無菌去離子水將實驗材料貯存液對倍稀釋成系列濃度的實驗材料液：32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 g·L-1。分別取上述不同濃度的實驗材料液2 mL，加18 mL溫度為48～50 ℃的BA瓊脂混合均勻后鋪板，配制成含系列濃度實驗材料溶膠的瓊脂平皿：32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5 g·L-1。每種材料相應濃度各3個平皿，以普通瓊脂平皿為空白對照。

采用瓊脂稀釋法，用微量加樣槍分別吸取濃度為1×104CFU·mL-1、1×103CFU·mL-1的糞腸球菌菌懸液5 μL，點種于含系列濃度實驗材料溶膠的瓊脂平皿表面。兩種濃度的菌懸液各點種3個點種點，一個平皿上共6個點種點。恒溫培養箱37 ℃有氧條件下培養24 h，計數菌落數。

1.3 統計學分析

采用SPSS 13.0軟件對不同實驗材料對兩種實驗濃度糞腸球菌的抗菌活性進行統計學比較分析。

2 結果

2.1 瓊脂擴散法結果

瓊脂擴散實驗表明，Ag/nHA、Yi/nHA、Ce/nHA、nHA、空白對照點種直徑分別為（5.75±0.38）、（5.89±0.48）、（5.95±0.33）、（6.04±0.38）、（6.05±0.06）mm，不同實驗材料點種直徑間差異無統計學意義（F=0.545，P>0.05）。不同實驗材料的抑菌環直徑大小有可比性。與空白對照相比，Ag/nHA周圍有明顯的抑菌環，抑菌環直徑為（8.17±0.70）mm，抑菌范圍為（2.42±0.44）mm。而Yi/nHA、Ce/nHA、nHA均未表現出抑制糞腸球菌的作用（圖1）。

2.2 瓊脂稀釋法結果

瓊脂稀釋實驗顯示，Ag/nHA對糞腸球菌的MIC為1.0 g·L-1。而Ce/nHA、Yi/nHA、nHA對糞腸球菌的MIC>32.0 g·L-1，在測試濃度范圍內均未表現出抑制糞腸球菌的作用（表1、圖2）。糞腸球菌菌懸液濃度對實驗材料抗菌活性的評價無明顯影響，1×103CFU·mL-1和1×104CFU·mL-1兩種濃度菌懸液實驗組間無統計學差異（表1）。

圖1 不同納米羥磷灰石復合材料對糞腸球菌的影響Fig 1 Effects of different nano hydroxyapatite composite material on Enterococcus faecalis

表1 細菌濃度對實驗材料抗菌活性的影響Tab 1 Effect of bacterial concentration on the experiment materials

圖2 含不同實驗材料瓊脂平皿上糞腸球菌的生長情況Fig 2 The growth of Enterococcus faecalis on different agar containing experimental materials

3 討論

糞腸球菌為兼性厭氧的條件致病菌，多定居在人類和動物的胃腸和泌尿生殖器官，也可定居在人類口腔[6]，可在多種口腔感染中檢出。糞腸球菌可單獨或與鏈球菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、牙齦卟啉單胞菌等細菌混合感染根管[7-8]。以往研究[9-11]發現未經治療的感染根管內糞腸球菌的檢出率為24%～42%；在慢性根尖周炎患牙根管中糞腸球菌的檢出率為60%，而在根管治療后再感染的病例中檢出率則高達76%；在根管治療失敗的病例中，糞腸球菌的檢出率為77%。甚至有實驗研究[12]表明，在已充填根管內糞腸球菌的陽性率高達80%。就診次數大于10次的13例根管治療病例中，12例感染根管內均可以檢測到糞腸球菌的存在[13]。糞腸球菌對機械預備及多種殺菌藥物具有廣泛的抵抗力[14]，并且可在組織液環境中粘接于牙本質膠原、侵入牙本質小管造成再感染，是難治性根尖周炎和根管治療后再感染的主要病原菌之一[15]，是評價根管治療過程中各種感染清除措施有效性最常采用的目標菌種。因此，本實驗選用糞腸球菌標準株作為實驗菌種。

復合納米羥磷灰石無機抗菌材料，具有納米材料和復合材料的雙重特性，具備耐高溫、抗菌譜廣、長效、安全、無二次污染等特點，逐漸成為抗菌材料領域的研究熱點，但對該類材料在根管治療領域的應用研究還比較少見。本課題選用的Ag/nHA、Ce/nHA、Yi/nHA、nHA是由四川大學納米生物材料研究中心采用溶膠-凝膠法原位制備的納米羥磷灰石復合材料，本身具有抗菌作用的金屬元素與具有較大表面能的納米羥磷灰石結合，顯示出獨特的生物活性。研究[16]表明，納米羥磷灰石對金黃色葡萄球菌有明顯和連續的抗菌性能；Ag/nHA對牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌、消化鏈球菌等多種口腔常見菌具有較強的抑制作用[17]；且適宜濃度的Ag/nHA對人牙齦成纖維細胞的生長繁殖無明顯抑制作用，生物相容性良好[14]；Yi/nHA對變異鏈球菌、黏性放線菌和牙齦卟啉單胞菌等口腔感染性疾病的主要致病菌有抑制作用[18]；經溶膠-凝膠-超臨界點干燥法合成的Ce/nHA由Ce3+替代羥磷灰石結構中的Ca2+，具有較高的溶解度，通過Ce3+的釋放來發揮對大腸埃希菌、乳桿菌的抑菌作用[19]。但關于此類材料對感染根管內的常見菌糞腸球菌影響的研究，國內外均尚未見報道。因此，本實驗選用四川大學納米生物材料研究中心提供的4種納米復合材料，通過體外評價其對糞腸球菌標準游離株的影響，擬篩選出一種對糞腸球菌有高效抑制作用的無機抗菌材料，并為該材料在根管治療領域的應用奠定實驗基礎。

藥物敏感實驗是根據致病菌對不同抗菌藥物敏感性的差異來測定抗菌藥物抑制或殺滅細菌能力的一種實驗方法，常用的有瓊脂擴散實驗和瓊脂稀釋實驗。瓊脂擴散實驗通過觀察實驗材料周圍抑菌環直徑的大小，初步評價不同實驗材料的抑菌性能。為了避免實驗材料擴散性因素的影響，本實驗將制備好的瓊脂平皿放置在室溫條件下1 h，并貯存于37 ℃、100%濕度的恒溫培養箱中24 h，以便于材料擴散。使用ProtoCOL SR全自動抑菌環測量儀測量抑菌環直徑大小，在一定程度上避免了人工測量引起的誤差，具有一定的實用性。

本研究的瓊脂擴散實驗和瓊脂稀釋實驗結果均表明，Ag/nHA對糞腸球菌有較好的抑制作用，其MIC為1.0 g·L-1；而其Ce/nHA、Yi/nHA和nHA在測試濃度范圍內均未表現出抑制糞腸球菌的作用。以往研究[20]發現銀離子本身具有較強的抗菌活性，可通過分裂細菌細胞膜、干擾細菌呼吸鏈、抑制細菌DNA合成等多重殺菌機制，對銀離子耐受的細菌很少，也難通過變異產生耐藥性。此外，銀離子的抗菌時效很長，并能抑制多源性細菌聚集。有學者[21]認為納米銀的作用方式與Ag離子相似，納米銀顆粒直徑極小（10～100 nm），它具備獨特的小尺寸效應和表面效應，可以令其輕易地進入病原體內，迅速與細菌中的巰基結合，降低細菌合成酶的活性，從而達到殺滅細菌的目的。納米銀的Ag＋還能破壞微生物的電子傳輸系統、呼吸系統和營養傳輸系統[22]。納米羥磷灰石作為吸附劑大大改善了材料對細菌的吸附能力，使Ag/nHA達到良好的殺菌作用。國內學者[23]研究發現，激光共聚焦顯微鏡下見隨著0.1%納米銀溶液處理牙本質表面時間的延長，糞腸球菌生物膜平均厚度逐漸減少，至24 h生物膜內無活菌。本課題組也在進一步研究Ag/nHA對體外牙根管內糞腸球菌生物膜的影響及其作用機制。Ag/nHA有望成為一種新型的根管治療藥物，使再感染根管患牙達到良好的治療效果，但其最佳臨床應用方法及其劑型有待進一步深入研究。

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