3D-人造皮膚模型在化妝品安全性、功效性評價中的應用

張春曉+杜鎮建+張興民

人類皮膚覆蓋于整個體表，被稱為生命之裳，不僅因為皮膚保護我們的肌肉和內臟免受環境中有害物質的侵害，還源于它的重要審美價值。人類追尋美麗的步伐從未停止過，《齊民要術》里就有各種關于如何配制護膚品的記載。進入21世紀，隨著我國人民生活水平的不斷提高，化妝品已經成為人們的生活必需品。如何保障化妝品的安全性和功效性，是政府監管部門、化妝品公司和消費者共同關注的問題。

在過去的三十年，化妝品的安全性檢測主要依靠動物試驗，然而動物試驗遭到動物保護組織的強烈反對。歐盟自2013年起，全面禁止出售和進口基于動物試驗的化妝品或原料。化妝品的功效性檢測一般是通過體外細胞試驗實現，不過鑒于人體皮膚組織的復雜性，簡單的體外細胞模型很難反應真實情況。

3D-人造皮膚模型為化妝品安全性、功效性評價提供了新的技術手段。3D-人造皮膚模型是將人的正常皮膚細胞培養于特殊的插入式培養皿上，得到具有三維結構的皮膚組織模型。如圖1，其表面形成角質層暴露于空氣中，可以將受試化妝品直接滴加在表面，模擬了將化妝品涂抹于局部皮膚表面的過程；基層細胞依靠底部培養基維持生長。3D-人造皮膚模型因為其組織結構和生理功能與正常皮膚組織十分相似，而成為良好的皮膚替代模型，并且在近年來被廣泛應用。目前商品化的3D-人造皮膚模型可以分為3類：表皮模型、全皮模型和黑色素皮膚模型。本文針對這3種模型，簡單介紹它們在化妝品安全性和功效性評價中的應用。

1 表皮模型

表皮模型顧名思義，與人類的表皮結構相似，僅由角質細胞構成，包括基底細胞層、棘細胞層、顆粒層和角質層。使用表皮模型替代動物試驗，進行化妝品及其原料的腐蝕性、刺激性檢驗，已經得到歐洲替代方法研究中心（European Centre for the Validation of Alternative Methods，ECVAM）的認可，經濟合作與發展組織（Organization for Economic Co-operation and Development， OECD）也頒布了相應的試驗指南（OECD Testing Guideline 431&439）。另外，ECVAM正在審批使用表皮模型進行皮膚光毒性檢測。

1.1 皮膚腐蝕性、刺激性檢測

檢測化妝品的皮膚毒性是安全性評價中的重要組成部分。將表皮模型用于皮膚腐蝕性、刺激性檢測，能很好地模擬化妝品滲透皮膚進入機體進而產生毒性的過程，而且操作簡便，只需將受試品滴加于模型表面，孵育相應時間，再使用MTT法檢測細胞活率，即可將腐蝕性、刺激性這類描述性詞語，轉換為具體的數據進行判斷。不僅保證了動物福利，而且過程更簡捷，結果更準確。

1.2 皮膚光毒性檢測

光毒性是指皮膚接觸化學物質后，再與紫外線接觸而產生的皮膚毒性反應。很多特殊用途化妝品，比如防曬霜，燙發、染發產品，它們的原料中都可能含有可產生光毒性的化學物質。使用表皮模型進行光毒性檢測，其過程是先將受檢物滴加于模型表面，然后暴露于一定照射劑量（通常為1.7 mW/cm2）的紫外線下一個小時，再使用MTT法檢測細胞活率。

2 全皮模型

人類皮膚包括表皮、真皮和皮下組織三個部分。真皮層含有成纖維細胞和膠原纖維，成纖維細胞與表皮中的角質細胞相互作用，促進角質細胞分裂、分化；膠原纖維為皮膚提供彈性。全皮模型包括表皮與真皮兩部分，表皮部分與表皮模型相似，真皮部分是由成纖維細胞和膠原基質組成。全皮模型在結構上與皮膚更相似，適合進行抗衰老、保濕等化妝品功效性研究。

2.1 抗衰老

抗衰老是國內外化妝品功效研究的熱門課題。衰老的明顯特征為皺紋產生和皮膚松弛，表現為表皮真皮連接處變平、彈性纖維和膠原纖維減少等情況。人類全基因組表達譜繪制的完成，幫助研究者鑒別出在皮膚老化過程中起關鍵作用的因子，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白和炎癥介質等。使用全皮模型做為抗衰老評價的體外模型，其優勢有兩個：第一，全皮模型具有角質層，可以將化妝品涂抹在上面，模擬化妝品作用于皮膚局部的過程；第二，全皮模型具有活的角質細胞、成纖維細胞，其生理功能與真實皮膚組織中的細胞相似，因此可以檢測抗衰老關鍵基因、蛋白的表達情況，從分子生物學角度評價化妝品的功效。

2.2 保濕作用

保濕是指通過使用相應化妝品維持肌膚，尤其是面部肌膚的含水量。保濕對于皮膚而言非常重要，因為皮膚與空氣直接接觸，水分非常容易流失。研究者發現人體皮膚中存在許多具有保濕作用的因子。如果在皮膚表面添加這些保濕因子，是否可以起到保濕作用呢？全皮模型為證明研究者的假設提供了有效的技術手段。

以透明質酸為例，研究者發現，透明質酸在表皮中負責保持皮膚的水分和彈性。隨著年齡的增長，表皮中的透明質酸含量逐漸降低，進而皮膚平整度降低皺紋產生。N-乙酰-葡萄糖胺是透明質酸的前體物質，煙酰胺是透明質酸合成的重要協同因子。研究者將N-乙酰-葡萄糖胺和煙酰胺加至全皮模型表面一段時間后，檢測發現透明質酸和膠原蛋白的基因表達與蛋白表達量均有上升，說明在皮膚表面施加N-乙酰-葡萄糖胺和煙酰胺，對于透明質酸的合成有促進作用。

3 黑色素皮膚模型

黑色素是人體皮膚的關鍵色素，主要功能是清除紫外線輻射給皮膚帶來的傷害，但同時也帶來膚色變暗、色斑生成等皮膚問題。皮膚美白是指通過使用特殊的化妝品抑制由紫外線照射所生成的黑色素，防止色斑的產生，恢復皮膚原本的色澤。這些化妝品中通常含有黑色素生成抑制劑，它們作用于黑色素形成的不同階段，比如抑制黑色素細胞被紫外線激活，抑制酪氨酸酶活性或是抑制黑素體轉移黑色素至角質細胞。無論是以何種原理或方式抑制黑色素生成，最終評價黑色素抑制劑是否有效，都需要測量黑色素含量。

黑色素由位于表皮基底層的黑色素細胞分泌。黑色素皮膚模型是在表皮模型的基礎上，添加正常人類黑色素細胞。這些黑色素細胞同樣位于表皮基底層，能夠自發地產生黑色素，然后通過黑素體傳遞給相鄰的角質細胞。因此可以利用黑色素模型評價化妝品對于黑色素的調節作用。

小結

傳統的化妝品安全性，采用動物試驗，例如向兔子的角膜滴加受試品，檢測其刺激性。不僅結果不準確—因為兔子的角膜與人類皮膚有很大的差別，而且十分殘忍，不符合動物福利。

化妝品功效性試驗，多是采用體外細胞培養，比如使用小鼠胚胎成纖維細胞（3T3）檢測光毒性，或是使用小鼠黑色素瘤細胞（B16）檢測黑色素抑制作用。這些體外試驗雖然可以提供一些有幫助的數據，但也都存在很多問題。首先，它們均使用小鼠或其他動物的細胞，甚至于腫瘤細胞，與人正常表皮細胞的生理功能相差甚遠；其次，這些體外試驗的細胞均是浸沒于培養基

中，實際上人類皮膚是暴露于空氣中，因此將化妝品加入到細胞培養液中，與將它們涂抹于皮膚表面之間存在明顯的差異；再次，化妝品的功效性評價一直存在主觀性過強的問題，因為像皺紋數量是否減少，皮膚含水量是否增多，皮膚是否變白，都是依靠人的肉眼觀察，然后進行判斷，這樣難免會見仁見智，出現偏差。

3D-人造皮膚模型利用特殊的氣液面培養方式，得到具有角質層的多層細胞組織結構，既可以模擬化妝品加于皮膚上的真實狀況，又可以將主觀判定的功效轉變為具體數據輸出，為化妝品功效性評價提供一個更加客觀、科學和準確的評價模型。endprint