喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響研究

劉曉霞，陳劍華，王雪玲，熊南燕，霍忠超

·論著·

喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響研究

劉曉霞，陳劍華，王雪玲，熊南燕，霍忠超

目的探討喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。方法選取昆明種小鼠70只，經(jīng)腹腔注射9×108/ml金黃色葡萄球菌菌液0．2 ml，選擇其中出現(xiàn)明顯發(fā)熱反應(yīng)小鼠40只，根據(jù)發(fā)熱程度編號(hào)并隨機(jī)分為空白對(duì)照組、頭孢唑林組、喜炎平注射液組及聯(lián)合用藥組，每組10只;另選10只直腸溫度正常小鼠作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠給予0．9%氯化鈉溶液腹腔注射，頭孢唑林組小鼠給予頭孢唑林腹腔注射，喜炎平注射液組小鼠給予喜炎平注射液腹腔注射，聯(lián)合用藥組給予喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林腹腔注射;各組小鼠均連續(xù)腹腔注射給藥7 d。計(jì)算各組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)及腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)。結(jié)果空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組(P＜0．05)。空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組(P＜0．05)。結(jié)論喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林可促進(jìn)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能恢復(fù)正常，繼而增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力及藥物殺菌作用。

葡萄球菌感染;金黃色葡萄球菌;小鼠;粒細(xì)胞;巨噬細(xì)胞;細(xì)胞吞噬作用;喜炎平注射液;頭孢唑林

劉曉霞，陳劍華，王雪玲，等．喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑啉對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響研究［J］．實(shí)用心腦肺血管病雜志，2015，23(4):54-57．［www．syxnf．net］

Liu XX，Chen JH，Wang XL，et al．Impact of xiyanping injection combined with and cefazolin on cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with staphylococcus aureus infection［J］．Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal Vascular Disease，2015，23(4):54-57．

抗生素的問(wèn)世具有劃時(shí)代意義，其作為臨床治療感染性疾病的常用藥，在多種微生物所致疾病的治療中發(fā)揮著重要作用，但隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌耐藥現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，抗生素使用劑量隨之增大，但療效卻未隨之明顯提高。為提高抗生素療效及縮短療程，臨床上常將一些具有清熱解毒、抗菌消炎等作用的中藥制劑與抗生素聯(lián)合用于治療感染性疾病，大量臨床研究表明，抗生素與中藥制劑聯(lián)合應(yīng)用治療感染性疾病具有協(xié)同作用［1-4］。本研究旨在探討喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，為臨床聯(lián)合應(yīng)用中藥制劑與抗生素治療感染性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠70只，雌雄各半，周齡6～8周，體質(zhì)量18～22 g。

1．2 試劑及菌株異硫氰酸熒光素(FITC)為Solarbio公司產(chǎn)品，紅細(xì)胞裂解液為天津?yàn)笊镏破酚邢薰井a(chǎn)品，肝素為湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，可溶性淀粉購(gòu)自北京博潤(rùn)萊特科技有限公司;金黃色葡萄球菌敏感菌株26001-25、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923、大腸埃希菌應(yīng)用菌株44102-3a7均購(gòu)自北京市藥品生物制品檢定所。

1．3 制備1%雞紅細(xì)胞懸液及6%可溶性淀粉肉湯溶液采雞心臟血，用肝素抗凝，2 500 r/min離心5 min，取沉淀紅細(xì)胞用0．9%氯化鈉溶液洗滌3次，再用0．9%氯化鈉溶液按體積配成1%雞紅細(xì)胞懸液備用;取肉湯培養(yǎng)基100 m l，加入可溶性淀粉6 g，混勻，水浴、煮沸、消毒，制成6%可溶性淀粉肉湯溶液備用。

1．4 造模方法及動(dòng)物分組所有小鼠于實(shí)驗(yàn)前用電子體溫計(jì)測(cè)量?jī)纱沃蹦c溫度，間隔時(shí)間為1 h，選擇兩次測(cè)量直腸溫度相近小鼠，給予每只小鼠經(jīng)腹腔注射9× 108/ml金黃色葡萄球菌菌液0．2 ml，1 h后再次測(cè)量直腸溫度，選擇出現(xiàn)明顯發(fā)熱反應(yīng)小鼠40只，根據(jù)發(fā)熱程度編號(hào)并隨機(jī)分為空白對(duì)照組、頭孢唑林組、喜炎平注射液組及聯(lián)合用藥組，每組10只;另選10只直腸溫度正常小鼠作為正常對(duì)照組。正常對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠給予0．9%氯化鈉溶液腹腔注射，70 mg/kg，2次/ d;頭孢唑林組小鼠給予頭孢唑林腹腔注射，70 mg/kg，2次/d;喜炎平注射液組小鼠給予喜炎平注射液腹腔注射，13 mg/kg，2次/d;聯(lián)合用藥組給予喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林腹腔注射，用量同上。各組小鼠均連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

1．5 外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能檢測(cè)

1．5．1 FITC標(biāo)記菌液培養(yǎng)16～18 h后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期大腸埃希菌，3 000 r/min離心15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，再用碳酸鹽緩沖液(CB，pH值9．5)配成濃度為0．5×109/ml細(xì)菌懸液，加入1 mg/m l FITC溶液使菌液終濃度達(dá)到5 μg/ml，37℃孵育2 h，3 000 r/min離心15 min后棄上清液，PBS洗滌2次，在用PBS配成1×109/ml細(xì)菌懸液。

1．5．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法各組小鼠于最后一次給藥后2 h采集球后靜脈叢0．8～1 ml，肝素抗凝;在兩支流式管中分別加入抗凝血100 μl和FITC標(biāo)記菌液20 μl，混勻后將其中1支流式管37℃水浴15 min，另1支流式管0℃水浴15 min;水浴完成后迅速取出流式管并放入冰中10 min，加入冷PBS 2 m l，1 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，室溫放置5 min，1 500 r/min離心10 min，棄上清液;加入冷PBS 2 m l洗滌2次，離心，棄上清液，PBS重懸細(xì)胞(至少包含10 000個(gè)細(xì)胞)，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率及吞噬指數(shù)。中性粒細(xì)胞吞噬率(%)=(吞噬細(xì)菌的中性粒細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)) ×100%，中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率(%)=37℃中性粒細(xì)胞吞噬率-0℃中性粒細(xì)胞吞噬率，中性粒細(xì)胞吞噬指數(shù)=熒光強(qiáng)度/總細(xì)胞數(shù)。

1．6 腹腔巨噬細(xì)胞功能檢測(cè)各組小鼠于第4次給藥后經(jīng)腹腔注射6%可溶性淀粉肉湯溶液1 ml，于最后一次給藥后1．5 h經(jīng)腹腔注射1%雞紅細(xì)胞懸液0．5 ml，再于30 min后收集腹腔液，涂片，經(jīng)瑞氏染色后鏡檢;每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞，且每張涂片重復(fù)計(jì)數(shù)3次取平均值;計(jì)算腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率和吞噬指數(shù):腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率(%)=(吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/200)×100%，吞噬指數(shù)=吞噬細(xì)胞吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/200。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 16．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能各組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)表1、圖1)。

表1 5組小鼠外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能比較(±s)Table 1 Comparison of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood among the five groups of mice

表1 5組小鼠外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能比較(±s)Table 1 Comparison of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood among the five groups of mice

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05;與空白對(duì)照組比較，△P＜0．05;與頭孢唑林組比較，▲P＜0．05

組別只數(shù)實(shí)際吞噬率(%) 10 6．83±2．42 3．28±1．04空白對(duì)照組10 3．54±1．49*1．15±0．86*頭孢唑林組10 2．66±1．73*1．47±0．43*喜炎平注射液組10 5．45±1．70△▲2．95±0．93△▲聯(lián)合用藥組10 6．88±1．84△▲3．16±0．91△▲F吞噬指數(shù)正常對(duì)照組0．000 0．000 10．57 13．79 P值值

圖1 5組小鼠外周血中性粒細(xì)胞37℃時(shí)細(xì)胞吞噬率流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Figure 1 Flow cytometer detection results of phagocytotic rate of neutrophil in peripheral blood among the five groups of mice(37℃)

2．2 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05，見(jiàn)表2、圖2)。

表2 5組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能比較(±s)Table 2 Comparison of cytophagocytosis of macrophages in enterocoelia among the five groups of mice

表2 5組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能比較(±s)Table 2 Comparison of cytophagocytosis of macrophages in enterocoelia among the five groups of mice

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05;與空白對(duì)照組比較，△P＜0．05;與頭孢唑林組比較，▲P＜0．05

組別只數(shù)吞噬率(%) 10 62．95±9．25 1．88±0．67空白對(duì)照組10 47．10±10．28*1．08±0．32*頭孢唑林組10 48．90±5．78*1．12±0．75*喜炎平注射液組10 60．30±9．74△▲1．79±0．61△▲聯(lián)合用藥組10 59．40±7．99△▲2．03±0．52△▲F吞噬指數(shù)正常對(duì)照組0．002 0．001 6．77 5．68 P值值

圖2 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞前后變化(瑞氏染色，×400)Figure 2 Changes of macrophagus before and after phagocytosis of chicken erythrocyte

3 討論

喜炎平注射液的主要成分為穿心蓮內(nèi)酯磺化物，具有清熱解毒、抗菌消炎等作用，臨床上主要用于治療上呼吸道感染、支氣管炎、病毒性肺炎、小兒腹瀉、細(xì)菌性痢疾等，常與抗生素聯(lián)合使用［5-6］。本研究前期進(jìn)行的體外研究發(fā)現(xiàn)，喜炎平注射液可增強(qiáng)頭孢類(lèi)抗生素的抗菌作用［7］，本研究旨在探討喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞

噬功能的影響。

機(jī)體主要通過(guò)固有免疫應(yīng)答和特異性免疫應(yīng)答而發(fā)揮抗感染作用，其中固有免疫應(yīng)答可在病原體入侵機(jī)體早期迅速反應(yīng)，及時(shí)清除病原體。吞噬細(xì)胞是固有免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。中性粒細(xì)胞在骨髓發(fā)育成熟后進(jìn)入血液，約占白細(xì)胞總數(shù)的55%～70%，具有趨化、吞噬、呼吸爆發(fā)等生物學(xué)特性。當(dāng)病原體進(jìn)入機(jī)體后，中性粒細(xì)胞活化并在趨化因子誘導(dǎo)下穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞而進(jìn)入血管間隙，繼而遷移至感染部位，與病原體接觸后形成偽足并將病原體包圍，中性粒細(xì)胞質(zhì)膜逐漸內(nèi)陷形成吞噬體，繼而發(fā)揮殺滅作用［8］。因此，吞噬是中性粒細(xì)胞殺滅病原體的前提條件，也是中性粒細(xì)胞發(fā)揮抗感染作用的關(guān)鍵。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠外周血中性粒細(xì)胞實(shí)際吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組，提示金黃色葡萄球菌感染可導(dǎo)致外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能受抑制，而頭孢唑林雖可殺滅金黃色葡萄球菌，但不能有效改善外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能，喜炎平注射液及其與頭孢唑林聯(lián)合應(yīng)用可減輕外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能受抑制程度，促進(jìn)外周血中性粒細(xì)胞吞噬功能恢復(fù)正常。

巨噬細(xì)胞由血液中單核細(xì)胞穿出血管后分化而成，分布于全身各處組織，可分為定居巨噬細(xì)胞和游走巨噬細(xì)胞兩大類(lèi)，其中定居巨噬細(xì)胞主要在相應(yīng)組織器官發(fā)揮抗感染作用。當(dāng)機(jī)體發(fā)生感染時(shí)，在病原體和細(xì)胞因子等刺激下血液中單核細(xì)胞大量穿出血管并分化為巨噬細(xì)胞，即游走巨噬細(xì)胞，而游走巨噬細(xì)胞不僅具有非特異性防御功能，可不斷清除體內(nèi)衰老、死亡及變異細(xì)胞，還具有激活特異性免疫應(yīng)答作用，可處理和提呈抗原，而巨噬細(xì)胞的這些作用均需通過(guò)其吞噬功能來(lái)完成，因此，巨噬細(xì)胞的吞噬功能直接關(guān)系著其抗感染作用［8］。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、頭孢唑林組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)低于正常對(duì)照組，喜炎平注射液組、聯(lián)合用藥組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬率、吞噬指數(shù)高于空白對(duì)照組和頭孢唑林組，提示金黃色葡萄球菌感染可導(dǎo)致腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能降低，而頭孢唑林不能有效恢復(fù)其吞噬功能，喜炎平注射液及其與頭孢唑林聯(lián)合應(yīng)用可促進(jìn)腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能恢復(fù)正常，繼而增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力。

綜上所述，喜炎平注射液聯(lián)合頭孢唑林可促進(jìn)金黃色葡萄球菌感染小鼠外周血中性粒細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能恢復(fù)正常，繼而增強(qiáng)機(jī)體抗感染能力及藥物殺菌作用，這為臨床聯(lián)合應(yīng)用中藥制劑與抗生素治療感染性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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［3］范文闖．頭孢呋辛鈉聯(lián)合清開(kāi)靈治療老年肺氣腫合并感染的療效［J］．中國(guó)老年學(xué)雜志，2012，32(3):491-492．

［4］王娟．清開(kāi)靈注射液聯(lián)合頭孢曲松鈉治療小兒肺炎臨床效果觀察［J］．中國(guó)婦幼衛(wèi)生雜志，2013，4(5):66．

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Im pact of Xiyanping Injection Combined w ith Cefazolin on Cytophagocytosis of Neutrophils in Peripheral Blood and M acrophages in Enterocoelia in M ice w ith Staphylococcus Aureus Infection

LIU Xiao-xia，CHEN Jian-hua，WANG Xue-ling，et al．
Medical College of Hebei University of Engineering，Handan 056002，China

Objective To investigate the impact of xiyanping injection combined with cefazolin on cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with Staphylococcus aureus infection．M ethods A total of 60 Kunming mice were selected at first，all of them were given intraperitoneal injection of Staphylococcus aureus bacteria liquid at dose of 0．2 m l(9×108/ml)，and then 40 mice with obvious fever were selected and randomly divided into groups A，B，C，D，each of 10 mice．A total of 10 mice with normal rectal temperature were selected as control group．Mice of control group and A group were given intraperitoneal injection of 0．9%sodium chloride injection，mice of B group were given intraperitoneal injection of cefazolin，mice of C group were given intraperitoneal injection of xiyanping injection，mice of D group were given intraperitoneal injection of xiyanping injection combined with cefazolin;all of the five groups were continuously injected for 7 days．Actual phagocytosis rate and phagocytic index of neutrophils in peripheral blood，phagocytosis rate and phagocytic index of macrophages in enterocoelia were calculated．Results Actual phagocytosis rate and phagocytic index of neutrophils in peripheral

Staphylococcal infections;Staphylococcus aureus;Mice;Granulocytes;Macrophages; Cytophagocytosis;Xiyanping injection;Cefazolin

R 515．9

A

10．3969/j．issn．1008-5971．2015．04．016

2014-12-02;

2015-03-10)

(本文編輯:鹿飛飛)

河北省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(12276104D-63)

056002河北省邯鄲市，河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院(劉曉霞，陳劍華，王雪玲，熊南燕);河北工程大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院(霍忠超)

王雪玲，056002河北省邯鄲市，河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院;E-mail:wangxuelingcool@126．com

blood，phagocytosis rate and phagocytic index of macrophages in enterocoelia of groups A and B were statistically significantly lower than those of control group(P＜0．05)，those of groups C and D were statistically significantly higher than those of groups A and B(P＜0．05)．Conclusion Xiyanping injection combined with cefazolin can promote the recovery of cytophagocytosis of neutrophils in peripheral blood and macrophages in enterocoelia in mice with Staphylococcus aureus infection，improve the body' s resistance to infection and the drugs'disinfection effect．