肝臟蛋白質組學的方法學研究進展

樊昊 丁文 徐琰

(鄭州大學基礎醫學院 河南鄭州 450001)

“蛋白質組(proteome)”指的是由1個基因組表達的全部蛋白質，1994年Marc Wilkins在意大利Siena會議上提出了這一概念。蛋白質組學(proteomics)是指應用各種技術手段來研究蛋白質組的學科，其目的是從整體的角度研究生物機體、組織、細胞甚至細胞器基因編碼的全部蛋白質，包括蛋白的組成、分布、種類、功能、代謝特征及其動態變化規律等［1］。

肝臟是身體內以代謝功能為主的器官，起著去氧化、儲存肝糖、分泌性蛋白質的合成等作用。肝病是一種世界范圍性的疾病，常見有肝炎、肝硬化、肝膿腫、原發性肝癌等。肝功能的損傷對患者全身器官組織都具有不同程度地損害，嚴重影響患者的生活。目前還沒有人工器官能夠完全取代肝臟的功能［2］。

蛋白質是生命活動和生物結構最主要的實際承擔者，從整體水平出發的肝臟蛋白質組學研究可更貼近生命本質的去理解肝臟的生命活動規律和特點。同時肝臟蛋白質組學的研究也能為新興的肝臟基因治療的發展和臨床運用提供幫助［3］。因此，肝臟蛋白質組學的研究備受重視。早在2002年國際蛋白質組第一次研討會上，我國科學家倡導并提出了開展人類肝臟蛋白質組計劃的建議。2007年8月22日，我國科學家成功測定出6 788個高可信度的中國成人肝臟蛋白質，系統構建了國際上第1張人類器官蛋白質組“藍圖”［4］。

隨著蛋白質組學研究方法的更新和完善，蛋白質組學研究得以進一步深入。目前已有數種比較健全的蛋白質組學研究體系，而對不同生物體、不同階段、不同狀態的蛋白質組研究需要使用不同的方法。本文將對目前運用于肝臟研究的常用蛋白質組學方法進行簡要綜述，為研究者提供方法學上的建議，展望蛋白質組學在肝臟研究領域的新空間。

1 蛋白質分離技術

1.1 雙向凝膠電泳(two－dimensional electrophoresis，2－DE)常用的2－DE技術主要為二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D －PAGE)以及雙向熒光差異凝膠電泳(two－dimensional fluorescence difference gel electrophoresis，DIGE)。2D－PAGE是目前最為常用的蛋白質組學分離方法之一，實用性高。DIGE則可以對實驗組和對照組的蛋白質表達進行更精確且可重復的定量分析。雙向凝膠電泳獲得的數據已經有專門的系統管理。如:PARIS(proteomic analysis and resources indexation system)系統［5］，儲存了電泳圖像和信息，可供研究者搜索使用。根據2－DE相關技術，可以對肝臟蛋白質組中的目標蛋白進行分離［6］，在不同的pH值段構建蛋白質參考譜，以便于進一步的分析［7］。對于同種蛋白，借助參考譜的對照，可以確定其亞基(如巰基等)等結構的變化，或者檢測其修飾程度［8］。進而在肝病研究中，可以通過分析肝臟疾病中蛋白質的變化，探究蛋白質的變化與肝臟疾病發生的關系［9］。然而，目前2－DE方法還存在著很多缺陷:蛋白質電泳行為易受樣品中雜質影響;難溶于樣品緩沖液的疏水性蛋白在圖譜上難以顯示;一些特殊蛋白易在電泳中降解和丟失;實驗重復性較差等［10］。故為適應不同組織或細胞的特殊理化性質，需要針對不同來源的樣品進行預分離等處理，以獲得足夠量、高純度的蛋白質樣品用于后續實驗。

1.2 高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)HPLC采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成份分離、成分定性并進行定量分析。其分析速度快，通常分析1個樣品在15～30 min;分離效能高;可優化固定相和流動相以達到最佳分離效果;70%以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，其優勢十分明顯。其不足之處在于分析成本高，分析時間較長。肝臟蛋白質組中的蛋白含量大，種類繁多，低濃度的蛋白不易被檢測出。運用HPLC可以精準地檢測樣品中的目標蛋白［11］，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析。在亞細胞結構中的蛋白分析如檢測蛋白質的修飾程度中具有較好前景［12］。同時HPLC在肝臟藥物的提取和加工中也有廣泛的利用［13］。

1.3 親和層析(affinity chromatography) 親和層析是利用親和力，分離蛋白質混合物中能特異結合配體的目的蛋白或其他分子的層析技術。其特異性強、操作簡便，對含量少又不穩定的活性物質更為有效，并可得到高產率的純化產物。但是，只有那些具有配基的生物分子才能用親和層析分離，具有較高局限性。在肝臟蛋白質組學的研究中，親和層析技術能夠快速高效地分離出特征較明顯的目標蛋白(如磷酸化修飾后的蛋白等)［14］。對于已知蛋白的提取和分離具有較好效果。也可以針對凝聚素(如DSA等)，對能與其親和的不同蛋白質進行研究［15］。

1.4 毛細管電泳(capillary electrophoresis，CE) CE是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術［16］。CE技術使納米級的分析成為可能，其系統可實現在線自動分析，一般十幾分鐘即可完成一次樣品分析;同時維持費用較低。其缺點是制備能力差，對復雜樣品存在分離不完全的現象。實驗中CE常與質譜聯用，可以彌補紫外檢測器由于通過樣品的光程較短導致靈敏度低的問題。肝臟蛋白質組學的研究中，CE技術可用于相對分子質量范圍不適于2－DE的樣品。相比其他方法CE具有更好的泛用性［17］，對于定量的肝臟蛋白質組學研究效果較好［18］。

2 蛋白質鑒定技術

2.1 質譜技術(mass spectrometry，MS)MS鑒定蛋白質的基本原理是先使樣品分子離子化，然后根據不同離子之間的質荷比(m/z)的差異來分離并確定蛋白質的相對分子質量［19］。MS技術具有靈敏、準確、高通量、自動化等特點。質譜技術可達到對蛋白質的快速鑒定和高通量篩選［20］。但是MS還存在固有的局限性，質荷比相似的蛋白質不能區分等。MS廣泛運用于肝臟蛋白質組學研究的各個方面。MS可以運用于大規模的肝臟蛋白質組分析，一次性收獲大量數據［21］;以肝臟蛋白質峰為模型等進行宏觀方向的研究［22］;對于20個氨基酸以下的肽段，MS還能進行翻譯后修飾的分析(糖基化、磷酰化)。

2.2 鳥槍法(shotgun)蛋白質鳥槍法是一種自下而上(bottom－up)的技術路線，增進了低豐度蛋白、疏水性蛋白的分離和檢測能力;回收率高，可保持蛋白質完整性和活性。該方法可在短時間內獲得大量鑒定結果［23］，因此在蛋白質組研究中被廣泛采用。其局限性在于:鳥槍法的重復性、可靠性以及信息的詳細程度相對較差。鳥槍法能高效地分析肽段上的變化，適用于探究特定模型下蛋白表達的差異以及蛋白修飾程度［24］，以及蛋白質的加成與復雜基體中的活性代謝物的鑒定［25］。但是通過蛋白質直接酶切得到的肽混合物過于復雜，不適合實現對肝細胞全部蛋白質的識別與鑒定。

2.3 同位素標記親和標簽技術(isotope－coded affinitytag，ICAT)ICAT技術在蛋白質組學研究應用較多的便是免疫印跡法(western blot)，利用ICAT技術單獨選擇某一種蛋白質，檢測其表達含量的變化。ICAT技術可以對混合樣品直接測試;能夠快速定性和定量鑒定低豐度蛋白質;還可以快速找出重要功能蛋白質，其靈敏度和準確性高。但是ICAT對不含半胱氨酸的蛋白質無法分析。其標簽試劑本身是種相當大的修飾物，并在整個MS分析過程中保留在每個肽段上，這使得數據庫搜索的算法復雜。在肝臟蛋白質組學中，ICAT常用于鑒定某種蛋白，并能對蛋白進行定性和半定量分析［26］。同時通過檢測蛋白質的表達水平，也可以檢測基因表達程度［27］。結合化學發光檢測，可以同時比較多個肝組織樣品同種蛋白的表達量差異［28］。

2.4 相對和絕對定量同位素標記(isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ) iTRAQ技術是一種體外同位素標記技術。其優勢在于可以對一個基因組表達的全部蛋白質或某個復雜的混合體系中的所有蛋白質進行精確定量和鑒定，用于尋找差異表達蛋白。然而iTRAQ試劑易受雜質蛋白以及緩沖液的污染，需要對樣本進行預處理，對操作要求較高。此外還有成本較高等問題［29］。iTRAQ能對目標蛋白進行精確定量分析，在肝臟蛋白質組學的研究中，適用于差異蛋白的定量比較，可用于檢測藥物療效，高效監測生物標記物變化［30］。

3 結語

選擇正確有效的技術對于蛋白質組學的研究事半功倍。此次選擇了關注度較高的數種蛋白質組學的研究方法，在PubMed上搜索近5年來的有關文章數，從中分析有關方法的熱度變化。分離方法中，2－DE介于較高的操作難度以及較差的重復性，近年的關注度有所下降;HPLC現已經在金屬分析等領域中具有較多運用，在肝臟蛋白質組學研究中頗具潛力;CE以及親和層析雖熱度不高但前景良好。鑒定方法中，MS能提供海量的通量信息，是其他技術所不能比擬的;ICAT及iTRAQ目前運用較多，在定量蛋白分析中具有良好的效果;鳥槍法對于肽段鑒定的效果良好，但在蛋白質整體檢測的效果上仍有待提高。希望本文能為諸位肝臟蛋白質組學者在研究方法選擇上提供一些幫助。

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