幾種植物精油對冬棗病原菌的抑菌試驗

摘 要：以冬棗為試材，從發病的冬棗上提取出病原菌，并進行分離純化和鑒定，明確導致冬棗發病的病原菌主要為酵母菌和根霉菌。使用濾紙片法測定5種植物精油（羅勒精油、松紅梅精油、薰衣草精油、紅百里香精油、迷迭香精油）對酵母菌和根霉菌的抑菌活性，結果表明：紅百里香精油對酵母菌和根霉菌都具有很強的抑制作用，抑菌圈直徑為（22.43±0.06） mm和（23.48±0.06） mm。另外，采用試管濃度稀釋法對5種植物精油的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）進行了測定，得知紅百里香精油對酵母菌的MIC值是0.625 μL/mL，MBC值是1.25 μL/mL；對根霉菌的MIC是0.625 μL/mL，MBC值是2.5 μL/mL。

關鍵詞：植物精油；病原菌；抑菌圈；抑菌濃度；殺菌濃度

文章編號：1005345X（2015）01000104中圖分類號：S436.65文獻標識碼：B

果蔬產品在采后會發生一系列生理病理的變化，冬棗在貯藏后期隨著果實的成熟衰老，其抗病性也逐漸降低，腐爛率也大大增加。傳統的冬棗保鮮所采用的都是成本低廉、使用方便、效果顯著的化學殺菌劑，但是大規模地使用化學殺菌劑不僅會導致病原菌產生抗藥性，還會造成果蔬的農藥殘留和污染環境[1]，這與現如今人們所追求的綠色、環保以及吃健康食品的觀念背道而馳。因此研究開發無毒、高效的天然防腐保鮮劑已成為一項極為迫切的任務。

近年來，植物精油以其顯著的抑菌活性和廣泛的抗菌譜范圍，以及與化學抑菌劑相比副作用和殘留毒性小的獨特優勢，在抑菌研究方面得到了廣泛的關注，被認為是開發天然防腐保鮮劑的重要原料[2，3]。目前植物精油對冬棗主要采后致病菌的抑制效果研究較少，冬棗精油天然防腐保鮮劑的開發也鮮見報道。本實驗以陜西地區冬棗采后貯藏中分離鑒定的病原菌作為供試菌種，對5種天然植物精油（羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油、迷迭香精油）進行抑菌試驗，篩選可有效抑制病原菌的植物精油，為冬棗采后病害的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

冬棗為陜西渭南市售的在半紅期采摘的果實，挑選無病蟲害和機械傷的鮮果用流動水沖洗，表面自然瀝干，置于室溫進行貯藏，讓其在貯藏的過程中病變。

植物精油羅勒精油、薰衣草精油、紅百里香精油、松紅梅精油和迷迭香精油均購自上海雅琪實業有限公司，試驗前置于低溫（4 ℃）避光環境下保存。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離與純化 采用常規方法，在PDA培養基中分離病原菌，待產孢后對病原菌孢子進行濃度梯度稀釋，涂于平皿，并在28 ℃培養2 d后于倒置顯微鏡下挑取單孢子，移入另一裝有PDA的平皿，28 ℃培養，待菌絲長出后，即得純化菌株。

1.2.2 標準菌懸液的制備 挑取各菌落接種到平皿上，進行培養， 然后用無菌生理鹽水洗

山西果樹 SHANXI FRUITS 2015（1）

脫，分別制成含菌約為1 mL 106個菌的菌懸液，備用。霉菌、酵母菌使用顯微鏡直接計數法測菌體個數[4，5]。

1.2.3 濾紙片法測定抑菌圈 選擇吸水性強的定性濾紙，用打孔器打成若干直徑為6 mm的圓形濾紙片，放入電熱干燥箱中經160 ℃干熱滅菌2 h后，把滅好菌的濾紙片放入植物精油中浸漬4 h，取出濾紙片放在無菌的條件下瀝干備用。將活化并調整好菌液濃度的酵母菌菌懸液0.1 mL加入已經倒好的YPD培養基平皿中，根霉菌倒入察氏培養基平皿上，并涂布均勻。取浸泡過精油的濾紙片貼在含菌平皿上，每皿平行做3片，每種菌平行做3個皿。然后用相應的提取溶劑作陰性對照，用青霉素G作陽性對照。酵母菌、根霉菌置培養箱中28 ℃恒溫培養48 h。選取抑菌圈比較明顯的平板，用十字交叉法測量菌落生長的直徑，結果取3次重復試驗的平均值[68]。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 在無菌條件下，將植物精油稀釋成下列不同濃度梯度：200、100、50、25、12.5、6.25 μL/mL。吸取各濃度稀釋液1 mL，分別加到已滅菌的9 mL PDA培養基中制成帶藥的平皿，編號后吸取待測菌種的懸浮液100 μL于平皿表面，涂布均勻，酵母菌、根霉菌置于恒溫箱28 ℃下培養48 h，以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的最低抑菌濃度（MIC）[9，10]。

1.2.5 最低殺菌濃度（MBC）的測定 將在測定最低抑菌濃度（MIC）試驗中沒有長菌的平皿繼續培養48 h后取出觀察，以完全無菌生長的為最低殺菌濃度（MBC）[11]。

2 結果與分析

2.1 冬棗病原菌鑒定

從貯藏的冬棗果實上分離出兩種病原菌，挑取各菌落少許到載玻片上，用顯微鏡觀察、測量，根據各病原菌的形態特征對其進行鑒定。經過鑒定冬棗上分離出的兩種病原菌是酵母菌和根霉菌。

酵母菌菌落呈現乳白色，少數為紅色，表面光滑濕潤，質地柔軟不透明，菌落直徑為1～2 mm。孢子為圓形，單生或成串。

根霉菌菌落呈圓形，初形成時為灰白色和黃白色，成熟后變為黑色，匍匐菌絲弧形，無色，向四周蔓延。孢子囊剛出現時為黃白色，成熟后變為黑色。

2.2 5種植物精油對冬棗病原菌抑制效果

2.2.1 抑菌圈的大小 5種植物精油、無菌生理鹽水和青霉素G對冬棗病原菌的抑菌作用如表1。參照李春美等[12]抑菌實驗判定標準（抑菌圈直徑大于15 mm為最敏感，10～15 mm時為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，無抑菌圈者不敏感），認為5種植物精油中紅百里香精油對兩種病原菌表現出了最強的抑菌活性，抑菌圈直徑均大于20 mm，屬最敏感；羅勒精油對根霉菌的抑制作用僅次于紅百里香精油，也屬最敏感，而對酵母菌屬于中度敏感；薰衣草精油、松紅梅精油對酵母菌的抑菌圈直徑介于7～9 mm，屬低度敏感，而這兩種精油對根霉菌屬中度敏感；迷迭香精油對酵母菌屬低度敏感，而對根霉菌屬中度敏感。綜合比較來看，5種精油對根霉菌的抑制作用要強于對酵母菌的抑制作用。

2.2.2 5種植物精油MIC的測定 表2列出了供試菌種在不同精油濃度下生長狀況和MIC值，精油的MIC值越小，說明精油抑制作用越強。從表3中可以看出，酵母菌和根霉菌在不同濃度的精油作用下，生長狀況差異明顯，試驗所得到的MIC值與濾紙片法所得到的結

宋姝婧等：幾種植物精油對冬季病原菌的抑菌試驗

果是基本一致的。紅百里香精油對酵母菌和根霉菌都表現出了強烈的抑制作用，最低抑菌濃度均為0.625 μL/mL；而羅勒精油對根霉菌表現出的抑制作用遠遠大于對酵母菌所表現的抑制作用，對酵母菌的MIC是10 μL/mL，對根霉菌的MIC是1.25 μL/mL ；松紅梅精油和迷迭香精油對根霉菌抑菌作用較弱，而對于酵母菌的抑制作用極小，超出了實驗所設的濃度梯次范圍；迷迭香精油對根霉菌的MIC為20 μL/mL；薰衣草精油對酵母菌和根霉菌也都表現出了一定的抑制作用，對酵母菌的MIC為20 μL/mL，對根霉菌的MIC為10 μL/mL。

2.2.3 5種植物精油MBC的測定 表3列出

了供試菌種在不同精油濃度下生長狀況和MBC值。從表3中可以看出，紅百里香精油對酵母菌和根霉菌都表現出了強烈的殺菌能力，紅百里香精油對酵母菌和根霉菌的MBC值分別是1.25 μL/mL和2.5 μL/mL，為5種植物精油中最低的殺菌濃度；相對酵母菌，羅勒精油對根霉菌表現出了更強的殺菌能力，MBC值分別為20 μL/mL和5 μL/mL；其余幾種精油對供試菌的殺菌能力都比較弱。

3 結論

對貯藏的病變冬棗上的病原菌進行分離、提純、鑒定，結果表明導致冬棗病變的主要病原菌為酵母菌和根霉菌。5種植物精油均對酵母菌、根霉菌有一定的抑制能力，其中紅百里香精油對酵母菌和根霉菌有著最強的抑制作用，抑菌圈直徑分別為（22.43±0.06） mm、（23.48±0.06） mm。紅百里香精油對酵母菌的MIC值是0.625 μL/mL，MBC值是1.25 μL/mL，對根霉菌的MIC是0.625 μL/mL，MBC值是2.5 μL/mL。另外，5種植物精油均表現出對根霉菌的抑制效果強于酵母菌的特點，其作用機理尚需進一步研究。綜上，紅百里香精油對冬棗采后病原菌有很強的抑制能力，可作為開發冬棗天然防腐保鮮劑的重要原料，關于其對冬棗的保鮮防腐效果尚需具體研究，使其更具實際應用性。

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